PESQUISA DE Paenibacillus larvae subsp. larvae
BRASIL. Instrução Normativa n°. 62 de 26 de agosto de 2003. Análises microbiológicas para controle de produção de origem animal e água. Diário Oficial da União, Brasília, 18 set. 2003.
1. OBJETIVOS E ALCANCE
Estabelecer metodologia analítica para a detecção de Paenibacillus larvae subsp. larvae (referido no restante do texto como P. larvae), agente da enfermidade Cria Pútrida Americana. A metodologia destina-se à verificação da presença de esporos do agente em amostras de produtos da colméia.
2. FUNDAMENTOS
2.1 Preparo da Amostra; O aquecimento da amostra a 45ºC visa diminuir a viscosidade, permitir a distribuição homogênea dos esporos e facilitar a manipulação. A diluição com solução salina tamponada, além de viabilizar a concentração dos esporos pela centrifugação que se segue, contribui para bloquear parcialmente a ação inibidora de crescimento bacteriano, exercida por substâncias presentes no mel.
2.2 Centrifugação; Visa concentrar os esporos presentes na amostra por meio de centrifugação a 3.000 x g por 30 minutos (g = 0, 0000118 x raio do rotor (cm) x rpm2).
2.3 Choque Térmico; Por meio do aquecimento, a 80ºC por 10 min., do sedimento da amostra obtido por centrifugação, obtém-se a eliminação das formas vegetativas de bactérias que podem interferir no crescimento de Paenibacillus larvae e dificultar a seleção de colônias.
2.4 Isolamento e Seleção; Baseia-se na semeadura sobre a superfície seca de ágar Paenibacillus larvae (ABL), meio composto por ágar estoque, ágar soja triptona, ágar Cereus (PEMBA) - base, suplementado com emulsão de gema de ovo, ácido nalidíxico e ácido pipemídico. A emulsão de gema de ovo promove a multiplicação de P.larvae e permite a diferenciação de microrganismos pela reação da lecitinase. A presença de 0,1% de peptona, associada ao piruvato de sódio (presentes no PEMBA), evidencia a precipitação da lecitina da gema do ovo, provocada por espécies de Bacillus que possuem essa propriedade. O manitol, carboidrato presente no meio, não é fermentado pelo Paenibacillus larvae. O indicador de pH presente no meio é o azul de bromotimol. O ácido nalidíxico atua inibindo total ou parcialmente o crescimento de P. alvei, B. megaterium, P.larvae subsp. pulvifaciens, P. polymyxa e B. pumilus. O ácido pipemídico atua prevenindo o crescimento de B. circulans, B. subtilis, B. licheniformis, B. cereus, B. mycoides, P.larvae subsp. pulvifaciens e P. apiarius.
2.5 Provas confirmativas: Baseiam-se na observação das características morfológicas e tintoriais; na observação da capacidade de decompor a caseína; na incapacidade de produzir catalase; no crescimento escasso em ágar nutriente isento de extrato de levedura e no crescimento típico no ágar leite com tiamina (ALT).
3.REAGENTES E MATERIAIS
Vidraria e demais insumos básicos obrigatórios em laboratórios de microbiologia;
Tubos para centrífuga tipo Falcon ou similar, com tampa rosqueável, cap. 100 mL;
Ágar cereus (PEMBA) - base* (opcional: ágar manitol gema de ovo poliximina segundo Mossel (MYP) - base);
Ágar estoque*;
Ágar soja triptona*;
Emulsão de gema de ovo 50%*;
Ácido pipemídico solução 0,2%*;
Ácido nalidíxico solução 0,1%*;
Tiamina cloridrato solução aquosa 0,1%**;
Leite desnatado UHT**;
Ágar ágar com extrato de levedura**;
Ágar nutriente sem extrato de levedura;
Caldo cérebro-coração com tiamina (BHIT);
Solução salina fosfatada tamponada pH 7,2 (PBS);
Peróxido de hidrogênio 3%;
Caldo experimental para anaeróbios;
* Componente do ágar Bacillus larvae (ABL);
** Componente do ágar leite com tiamina (ALT).
4. EQUIPAMENTOS
Centrífuga (3.000 x g);
Banho-maria a 80ºC;
Termômetro 100ºC.
5. PROCEDIMENTOS
5.1 Preparo da amostra: Mel e produtos “in natura”: Aquecer a amostra em banhomaria a 45ºC para facilitar a manipulação da mesma e a homogeneização dos esporos presentes.
Transferir, assepticamente, 20 mL da amostra para tubo de centrifuga estéril e adicionar 30 mL de solução salina fosfatada tamponada (PBS).
Homogeneizar bem.
Produtos da colméia liofilizados: pesar, assepticamente, 5g do produto em tubo de centrífuga estéril e adicionar 45 mL de PBS.
Deixar em repouso por 10 a 15 min. Homogeneizar bem.
Pólen: pesar, assepticamente, 5g da amostra e adicionar 45 mL de PBS misturando vigorosamente. Filtrar a mistura em papel filtro nº 2 (Whatman). Deixar em repouso por 2 horas para decantação do pólen residual. Transferir cuidadosamente para tubos de centrífuga estéreis com tampa.
5.2 Procedimentos de controle: Aplicar os procedimentos de controle específicos estabelecidos pelo laboratório.
5.3 Concentração por centrifugação
Centrifugar a 3.000x g por 30 minutos.
Após centrifugação, descartar cuidadosamente o sobrenadante.
Ressuspender o sedimento em 1 mL de PBS e transferir para tubos com tampa de rosca. Aquecer a 80ºC, em banho-maria, por 10 minutos.
5.4 Isolamento: Transferir 0,1 mL da suspensão preparada conforme item 5.3 para a superfície seca de placas com ABL. Com o auxílio de bastão tipo “hockey”, espalhar cuidadosamente o inóculo sobre a placa paralelamente, usando alça de 10 µL, inocular a suspensão por estrias sobre a superfície seca de outra placa com ABL.
Incubar as duas placas invertidas a 36 ± 1ºC por até 5 dias, observando, após 48h e depois diariamente, o crescimento de colônias típicas de Paenibacillus larvae.
No ABL, as colônias típicas de Paenibacillus larvae se apresentam planas, com superfície suavemente granulada, achatadas, com ou sem centro elevado de maior densidade, com bordas levemente irregulares, sem brilho, de cor verde- amarelada e diâmetro de 2 a 5mm, sem halo de precipitação da lecitina, com ou sem halo de lipólise.
Alguns isolados podem apresentar colônias com centro muitas vezes mais denso (opaco) que as bordas (translúcidas).
5.5 Seleção: Selecionar 3 a 10 colônias típicas e testar quanto à presença de catalase.
5.5.1 Prova da Catalase; Com auxílio de uma alça de platina, bastão de vidro, palito de madeira ou pipeta de Pasteur estéreis, retirar uma alíquota do cultivo, transferir para uma lâmina ou placa de vidro contendo uma gota de peróxido de hidrogênio a 3%.
Misturar o inóculo ao peróxido e observar a reação.
A não formação de borbulhas indica prova negativa para catalase.
A formação de borbulhas indica prova positiva para catalase.
As culturas de Paenibacillus larvae são catalase negativas.
Repicar as colônias catalase negativas para tubos contendo ágar leite com tiamina inclinado e incubar a 36 ± 1ºC por 24 a 48 h.
Manter essas culturas para testes complementares, caso sejam necessários.
5.6 Provas Confirmativas: Realizar as provas confirmativas completas em cada uma das colônias catalase negativas.
5.6.1 Coloração de Gram; Das colônias suspeitas, fazer esfregaço e corar pelo método de Gram.
O P.larvae se apresenta como bastonete Gram positivo, comumente longo e fino, porém, pode se apresentar de diversos tamanhos, em cadeias de comprimento variável.
As culturas que se apresentarem como suspeitas no Gram e catalase negativas devem ser testadas para:
5.6.2 Crescimento em superfície de ágar nutriente sem extrato de levedura: A partir das colônias catalase negativas, repicar também em tubos com ágar nutriente inclinado isento de extrato de levedura e incubar a 36 ± 1ºC por 3 dias.
A maioria dos Paenibacillus larvae apresenta escasso crescimento em ágar nutriente sem extrato de levedura após 3 dias.
5.6.3 Decomposição da caseína e verificação de crescimento típico no ALT
A partir das colônias catalase negativas, repicar sobre a superfície seca de placas com ágar leite com tiamina (ALT) e incubar a 36 ± 1ºC por 3 dias.
Após incubação, verificar a presença de halo transparente ao redor das colônias.
O Paenibacillus larvae decompõe a caseína em até 3 dias.
As colônias de Paenibacillus larvae subsp. larvae no ALT se apresentam de coloração entre branco e gelo, de aspecto sutil e delicado (pouco densas).
Diferenciação entre Paenibacillus larvae subsp. larvae e outros microrganismos relacionados comumente encontradas em amostras de produtos apícolas.
Microrganismos Decomposição da caseína Catalase Crescimento em Ágar nutriente sem extrato de levedura
P.larvae subsp. larvae POS* NEG NEG ou escasso
Paenibacillus alvei POS POS POS
Brevibacillus laterosporus POS POS POS
P.larvae subsp. Pulvifaciens POS NEG POS
Paenibacillus popilliae NEG NEG NEG
Paenibacillus lentimorbus NEG NEG NEG
Associado ao crescimento característico no ALT.
6. RESULTADOS
6.1 Interpretação
Considerar como P.larvae subsp. larvae as culturas que se apresentarem como bastonetes Gram positivos finos, médios a longos, dispostos em cadeias, catalase negativas, com reação positiva para hidrólise da caseína associada ao crescimento típico no ALT, e com crescimento escasso no ágar nutriente sem extrato de levedura em 3 dias.
6.2 Expressão do Resultado
Expressar o resultado das análises de mel como:
Pesquisa de Paenibacillus larvae subsp. larvae: Presença /20 mL de mel; ou
Pesquisa de Paenibacillus larvae subsp. larvae: Ausência /20 mL de mel.
Para outros produtos da colméia expressar o resultado como:
Presença (ou Ausência) / quantidade de amostra submetida à análise.
7. BIBLIOGRAFIA CONSULTADA
SCHUCH, D.M.T.; MADDEN, R.H.; SATTLER, A. 2001. An improved method for the detection and presumptive identification of Paenibacillus larvae subsp. larvae spores in honey J. Apicult. Res., 40(2): 59-64.
GOCHNAWER, T. A., CORNER, J. 1974. Detection and identification Bacullis larvae in a commercial pollen samples. J. Apicult. Res. 13: 264-267.
DSMZ - Deutsche SammLung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH. Bacterial Nomenclature Up-to-Date - (Approved Lists, Validation Lists).Nov. 2002. Braunschweig, Germany.Disponível In: http://www.dsmz.de/bactnom/bactname.htm
