CONTAGEM DE Staphylococcus aureus
BRASIL. Instrução Normativa n°. 62 de 26 de agosto de 2003. Análises microbiológicas para controle de produção de origem animal e água. Diário Oficial da União, Brasília, 18 set. 2003.
1. OBJETIVOS E ALCANCE
Estabelecer procedimento para a contagem de Staphylococcus aureus.
Aplica-se a amostras de matérias-primas e alimentos.
Para os produtos destinados ao comércio no MERCOSUL, a contagem final se referirá apenas a Staphylococcus coagulase positiva.
2. FUNDAMENTOS
2.1 Contagem: Baseia-se na inoculação das diluições desejadas das amostras em ágar Baird-Parker, cuja composição evidencia a habilidade desse microrganismo de crescer na presença de 0,01 a 0,05% de telurito de potássio em combinação com 0,2 a 0,5 % de cloreto de lítio e 0,12 a 1,26% de glicina.
O Staphylococcus aureus reduz anaeróbia e aerobiamente o telurito de potássio, produzindo colônias negras.
O ágar Baird-Parker suplementado com solução de gema de ovo possibilita a verificação das atividades proteolítica e lipolítica do Staphylococcus aureus , por meio do aparecimento de um halo de transparência e um de precipitação ao redor da colônia, respectivamente.
2.2 Prova da coagulase: Baseia-se na comprovação da capacidade de coagular o plasma de coelho pela ação da enzima coagulase produzida pelo microrganismo.
2.3 Provas complementares
2.3.1 Coloração de Gram: Baseia-se na verificação das características morfológicas e tintoriais do microrganismo.
2.3.2 Prova da termonuclease: Baseia-se na degradação do DNA em oligonucleotídeos pela ação da enzima DNAse produzida pelo microrganismo.
A reação é evidenciada pelo aparecimento de um halo de coloração rósea no ágar azul de toluidina e de clarificação, quando utilizado o ágar para teste de DNAse com verde de metila.
2.3.3 Prova da catalase: Baseia-se na capacidade da enzima catalase de decompor o peróxido de hidrogênio, liberando oxigênio, o que é evidenciado por meio da formação de borbulhas.
2.4 Limitações do Método: A metodologia para contagem de S. aureus, no que se refere aos resultados da prova de coagulase, apresenta limitações quanto à especificidade, devido ao fato de que algumas espécies de Staphylococcus relacionadas a animais, como o S. intermedius, S. hyicus, S. delphini e S. schleiferi ssp coagulans, também serem coagulase positivas.
Cepas de S. schleiferi ssp schleiferi e algumas cepas de S. lugdunensis apresentam fraca reação na prova da coagulase. Além disso, o S. schleiferi ssp schleiferi apresenta reação de termonuclease positiva.
3. REAGENTES E MATERIAIS
Vidraria e demais insumos básicos obrigatórios em laboratórios de microbiologia de alimentos;
Ágar Baird-Parker - base;
Ágar azul de toluidina - DNA ou Ágar para ensaio de DNAse, com verde de metila;
Ágar estoque;
Caldo cérebro-coração (BHI);
Solução salina peptonada 0,1%;
Solução salina 0,85%;
Emulsão de gema de ovo a 50%;
Telurito de potássio 3,5%;
Plasma de coelho oxalatado ou com EDTA;
Peróxido de hidrogênio 3%;
Etanol 70% ou Etanol 70º GL;
Reagentes para coloração de Gram.
4. EQUIPAMENTOS
Equipamentos básicos obrigatórios em laboratórios de microbiologia de alimentos.
5. PROCEDIMENTOS
5.1 Pesagem e preparo da amostra: Pesar 25 ± 0,2 g da amostra de acordo com as instruções contidas no Anexo V, “Procedimentos para o preparo, pesagem e descarte de amostras”, deste Manual.
Adicionar 225 mL de solução salina peptonada 0,1%.
Homogeneizar por aproximadamente 60 segundos em “stomacher”.
Essa é a diluição 10-1.
5.2 Procedimentos de controle: Aplicar os procedimentos de controle específicos estabelecidos pelo laboratório.
5.3 Inoculação: A partir da diluição inicial 10-1, efetuar as diluições desejadas de acordo com o Anexo II, “Diluições e soluções”, deste Manual.
Inocular, sobre a superfície seca do ágar Baird-Parker, 0,1 mL de cada diluição selecionada.
Com o auxílio de alça de Drigalski ou bastão do tipo “hockey”, espalhar o inóculo cuidadosamente por toda a superfície do meio, até sua completa absorção.
Utilizar no mínimo duas diluições decimais ou duplicata da mesma diluição.
Nos casos em que a legislação exigir valores menores que 100 UFC/g ou mL, distribuir em duplicata 1 mL da diluição 10-1 em 3 placas (0,4 mL, 0,3 mL e 0,3 mL). No caso de produtos líquidos poderá ser inoculado 0,1 mL diretamente da amostra (10o), o que corresponderá à diluição 10-1.
5.4 Incubação: Incubar as placas invertidas a 36 ± 1ºC por 30 a 48 horas.
5.5 Leitura: Selecionar as placas que contenham entre 20 e 200 colônias.
Contar as colônias típicas (T): negras brilhantes com anel opaco, rodeadas por um halo claro, transparente e destacado sobre a opacidade do meio.
Contar também colônias atípicas (A): acinzentadas ou negras brilhantes, sem halo ou com apenas um dos halos.
Registrar separadamente as contagens de colônias típicas e atípicas.
Selecionar 3 a 5 colônias de cada tipo (T) e/ou (A) e semear cada colônia em tubos contendo BHI, para confirmação.
Incubar a 36 ± 1ºC, por 24 horas.
Observação: para a obtenção do número final de UFC/mL ou g, utilizar, de preferência, apenas uma diluição, pois, uma colônia atípica pode tornar-se típica na diluição subseqüente em função da maior disponibilidade de nutrientes e pela menor competição bacteriana.
5.6 Prova da coagulase: Transferir 0,3 mL de cada tubo de cultivo em BHI para tubos estéreis contendo 0,3 mL de plasma de coelho.
Incubar a 36 ± 1ºC por 6 horas.
Verificar a presença de coágulos, considerando os critérios a seguir:
Reação negativa: não formação de coágulo;
Reação 1+ : coágulo pequeno e desorganizado;
Reação 2+ : coágulo pequeno e organizado;
Reação 3+ : coágulo grande e organizado;
Reação 4+: coagulação de todo o conteúdo do tubo, que não se desprenderá quando o tubo for invertido;
Quando a reação de coagulação for do tipo 3+ e 4+, considerar a prova positiva para Staphylococcus aureus;
Quando a reação de coagulação for negativa, considerar a prova negativa para Staphylococcus aureus.
Quando a reação for duvidosa do tipo 1+ e 2+, repicar do mesmo caldo de cultura para um tubo contendo ágar estoque ou outro contendo caldo BHI. Incubar a 36 ± 1ºC por 24 horas, para a realização dos testes complementares.
5.7 Testes complementares: A partir da cultura pura em BHI ou ágar estoque, realizar as seguintes provas confirmativas:
5.7.1 Coloração de Gram: Preparar esfregaço e corar pelo método de Gram.
A ausência de cocos Gram positivos indica teste negativo para Staphylococcus aureus. A presença de cocos Gram positivos indica a necessidade da realização de testes complementares.
5.7.2 Pesquisa de termonuclease: Fazer orifícios eqüidistantes com cerca de 2 mm de diâmetro no ágar para ensaio de termonuclease ou no ágar azul de toluidina - DNA, em placas previamente preparadas.
Colocar os tubos das culturas, mantidos em caldo BHI, em banho-maria fervente por 15 minutos.
Deixar esfriar e preencher completamente um orifício para cada cultivo a ser analisado.
Incubar a 36 ± 1ºC por 4 horas ou a 50 ± 2ºC por 2 horas.
O aparecimento, ao redor dos orifícios, de um halo rosa no ágar azul de toluidina ou de um halo de clarificação no agar para ensaio de DNAse com verde de metila, será indicativo de reação positiva para termonuclease.
Considerar como positivas as culturas que apresentarem halo de diâmetro superior a 1 mm. O Staphylococcus aureus é termonuclease positiva.
5.7.3 Prova da catalase: Com auxílio de alça de platina, bastão de vidro, palito de madeira ou Pipeta de Pasteur, estéreis, retirar uma alíquota do cultivo em ágar estoque e transferir para uma lâmina ou placa de vidro contendo uma gota de peróxido de hidrogênio a 3%.
Misturar o inóculo ao peróxido e observar a reação.
A não formação de borbulhas indica prova negativa para catalase.
A formação de borbulhas indica prova positiva para catalase.
O Staphylococcus aureus é catalase positiva.
6. RESULTADOS
Quando o número de colônias confirmadas for igual ao número de colônias selecionadas e repicadas, o resultado será igual à contagem inicial, levando-se em consideração a diluição utilizada.
Quando o número de colônias confirmadas for diferente do número de colônias selecionadas e repicadas, calcular a proporção de colônias positivas de acordo com o Anexo IV, “Procedimentos para contagem de colônias”, deste Manual.
O resultado final será a soma dos resultados de colônias típicas e atípicas confirmadas.
Expressar o resultado como:
Contagem de Staphylococcus aureus: X x 10y UFC/ g ou mL
ou
Contagem de Staphylococcus coagulase positiva: X x10y UFC/ g ou mL.
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