CONTAGEM TOTAL DE ENTEROBACTÉRIAS
BRASIL. Instrução Normativa n°. 62 de 26 de agosto de 2003. Análises microbiológicas para controle de produção de origem animal e água. Diário Oficial da União, Brasília, 18 set. 2003.
1. OBJETIVOS E ALCANCE
Estabelecer procedimento para a contagem de Enterobactérias.
Aplica-se a amostras de produtos de origem animal.
2. FUNDAMENTOS
2.1 Contagem: Baseia-se na inoculação das diluições desejadas das amostras testadas em ágar cristal violeta vermelho neutro bile glicose (VRBG), cuja composição evidencia a habilidade dos microrganismos fermentarem a glicose com produção de ácido, reação indicada por uma viragem do indicador a vermelho e a precipitação de sais biliares ao redor das colônias.
A seletividade é exercida pela presença de cristal violeta e bile no meio.
3. REAGENTES E MATERIAIS
Vidraria e demais insumos básicos obrigatórios em laboratórios de microbiologia de alimentos;
Ágar cristal violeta vermelho neutro bile glicose (VRBG);
Ágar estoque;
Solução salina peptonada 0,1%;
Reativo para oxidase (N'N'N'N'-tetrametil-parafenileno-diamina ou oxalato de para-amino-dimetilanilina), ou tiras de papel para teste de oxidase;
Reativos para coloração de Gram.
4. EQUIPAMENTOS
Equipamentos básicos, obrigatórios em laboratórios de microbiologia de alimentos.
5. PROCEDIMENTOS
5.1 Pesagem e preparo da amostra: Pesar 25 ± 0,2 g ou pipetar 25 ± 0,2 mL da amostra de acordo com as instruções contidas no Anexo V, “Procedimentos para o preparo, pesagem e descarte de amostras”, deste Manual.
Adicionar 225 mL de solução salina 0,1%.
Homogeneizar por aproximadamente 60 segundos em “stomacher”.
Esta é a diluição 10-1.
5.2 Procedimentos de controle: Aplicar os procedimentos de controle específicos estabelecidos pelo laboratório.
5.3 Inoculação: A partir da diluição inicial (10-1), efetuar as demais diluições desejadas em solução salina peptonada 0,1% de acordo com as instruções contidas no Anexo II, “Diluições e soluções”, deste Manual.
Inocular 1 mL de cada diluição em placas de Petri esterilizadas.
Adicionar a cada placa cerca de 15 mL de ágar cristal violeta vermelho neutro bile glicose previamente fundido e mantido a 46ºC-48ºC em banho-maria.
Homogeneizar cuidadosamente o inóculo com o meio e deixar em repouso até total solidificação. Após adicionar uma Segunda camada com o mesmo meio e deixar solidificar.
5.4 Incubação: Após completa solidificação do meio, incubar as placas em posição invertida em temperatura de 36 ± 1°C por 18 a 24 horas.
5.5 Leitura: Selecionar placas que contenham entre 15 e 150 colônias.
Contar as colônias de coloração vermelha, rodeadas ou não por halo de precipitação da bile presente no meio, com 0,5 a 2 mm de diâmetro e anotar os resultados de contagem.
Selecionar 3 a 5 colônias típicas e repicar para tubos com ágar estoque inclinado.
Incubar a 36 ± 1ºC por 24 horas.
Realizar a prova da oxidase conforme o item 5.6.
5.6 Prova da oxidase: Usando alça de platina, Pipeta de Pasteur, palitos de madeira estéreis, ou de plástico descartáveis estéreis, realizar a prova da oxidase espalhando a cultura sobre papel filtro impregnado com o reativo para oxidase ou sobre tiras de papel com reativo para oxidase, comercialmente disponíveis.
Fazer a leitura em 10 a 20 segundos. Após este tempo, reações falso-positivas podem ocorrer.
O aparecimento de cor azul (N'N'N'N'-tetrametil-parafenileno-diamina) ou vermelho intenso (oxalato de para-amino-dimetilanilina) é indicativo de reação positiva.
Não utilizar alças de níquel-cromo ou alças de aço inoxidável para realizar a prova da oxidase, pois traços de óxido de ferro na superfície flambada podem produzir reação falso-positiva.
Todas as enterobactérias apresentam reação de oxidase negativa.
5.7 Coloração de Gram: Das colônias oxidase negativas, preparar esfregaço e corar pelo método de Gram, seguindo as instruções contidas no Anexo VII, “Procedimentos de coloração”, deste Manual.
Todas as enterobactérias apresentam-se como bastonetes Gram negativos.
6. RESULTADOS
A partir dos dados obtidos, calcular o número de microrganismos presentes de acordo com o Anexo IV, “Procedimentos para a contagem de colônias”, deste Manual.
Expressar o resultado em UFC/g ou mL
7. BIBLIOGRAFIA CONSULTADA
KONEMAN, E.W.; ALLEN, S.D.; DOWELL, V.R.; JANDA, W.M.; SOMMERS, H.M.; WINN, W.C. Enterobacteriaceae . In: Diagnóstico micro-biológico. Texto y Atlas Color. 3ed. México, D.F.: Editorial Medica Panamericana. 1997, p.203-267.
MAC FADDIN , J.F. Pruebas Bioquimicas para la identificación de bacterias de importancia clínica. Buenos Aires: Editorial Médica Panamericana S.A. 1980, 275 p.
VARNAM, A.H.; EVANS, M.G. Foodborne Pathogens-Na illustrated text. London: Wolf Publishing Ltd. 1991, 557p.
