CONTAGEM DE Clostridium SULFITO REDUTORES E DE Clostridium perfringens
BRASIL. Instrução Normativa n°. 62 de 26 de agosto de 2003. Análises microbiológicas para controle de produção de origem animal e água. Diário Oficial da União, Brasília, 18 set. 2003.
1. OBJETIVOS E ALCANCE
Estabelecer procedimento para a contagem de Clostridium sulfito redutores e de Clostridium perfringens em alimentos.
Aplica-se a amostras de matérias-primas e alimentos.
2. FUNDAMENTOS
2.1 Contagem: Baseia-se na inoculação da amostra ou de uma diluição da mesma em meios de cultura seletivos. Após incubação em anaerobiose, os Clostridium formam colônias negras, devido à reação de redução de sulfito a sulfeto, que reage com citrato de amônio e ferro III, formando um precipitado negro.
2.2 Fermentação tempestuosa: Baseia-se na verificação da fermentação tempestuosa do leite presente no meio leite com ferro, característica do Clostridium perfringens.p.
Essa fermentação caracteriza-se por formação de coágulo bem definido, com grande formação de gás, durante incubação à temperatura seletiva de 46 ± 1ºC.
2.3 Testes confirmativos: A confirmação de Clostridium perfringens se faz por meio de provas confirmativas, com as quais se evidenciam suas características de: imobilidade, redução de nitratos, produção de ácido e gás a partir da lactose, fermentação da rafinose e liquefação da gelatina.
3. REAGENTES E MATERIAIS
Vidraria e demais insumos básicos obrigatórios em laboratórios de microbiologia de alimentos;
Solução salina peptonada 0,1%;
Ágar triptose - sulfito - cicloserina (TSC)- base ou Ágar
Sahid Ferguson Perfringens (SFP) -base;
Ágar estoque;
Ágar motilidade - nitrato tamponado;
Meio leite com ferro;
Meio lactose-gelatina;
Caldo vermelho de fenol-base;
Solução de rafinose 10% ;
Caldo de carne cozida (opcional caldo Tarozzi);
Meio tioglicolato;
Alfa naftilamina 0,5%;
Ácido sulfanílico 0,8%;
Solução de cicloserina 5%;
Polimixina B;
Kanamicina;
Vaspar ou óleo mineral ou parafina líquida;
Gerador de anaerobiose;
Reagentes para coloração de Gram.
4. EQUIPAMENTOS
Equipamentos básicos obrigatórios em laboratórios de microbiologia de alimentos.
5. PROCEDIMENTOS
5.1 Pesagem e preparo da amostra: Pesar 25 ± 0,2 g da amostra de acordo com as instruções contidas no Anexo V, “Procedimentos para o preparo, pesagem e descarte de amostras”, deste Manual.
Adicionar 225 mL de solução salina peptonada 0,1% e homogeneizar por aproximadamente 60 segundos em “stomacher”. Essa é a diluição 10-1.
5.2 Procedimentos de controle
Aplicar os procedimentos de controle específicos estabelecidos pelo laboratório.
5.3 Inoculação em Placas
A partir da diluição inicial 10-1, efetuar as diluições desejadas de acordo com o Anexo II, “Diluições e soluções”, deste Manual.
A partir das diluições escolhidas, semear alíquotas de 1 mL em placas estéreis e adicionar cerca de 15 mL de ágar TSC ou SFP em temperatura de 46 - 48ºC.
Homogeneizar cuidadosamente e deixar solidificar em superfície plana.
Após, adicionar uma segunda camada de cerca de 10 mL do mesmo meio.
Deixar solidificar em superfície plana.
5.4 Incubação: Imediatamente após a solidificação do ágar, incubar as placas (sem inverter), em jarra de anaerobiose a 36 ± 1ºC por 18 a 24 horas.
5.5 Seleção e Isolamento: As colônias típicas de Clostridium sulfito redutores são negras e de tamanho variável de 1 a 3 mm no ágar TSC e no ágar SFP.
Selecionar placas que contenham entre 20 e 200 colônias típicas.
Contar todas as colônias negras presentes. Anotar o resultado.
Esse resultado, multiplicado pela diluição usada, corresponde ao número de Clostridium sulfito redutores presentes por grama da amostra em análise.
Escolher 5 colônias negras e repicar para tubos com ágar estoque. Incubar em anaerobiose a 36 ± 1ºC por no mínimo 24 horas. Paralelamente, repicar para meio tioglicolato ou caldo de carne cozida (com selo estéril de vaspar ou vaselina ou parafina líquida ou óleo mineral).
5.6 Testes confirmativos para Clostridium perfringens
5.6.1 Coloração de Gram: A partir de cultura pura em ágar estoque ou dos meios usados paralelamente, preparar esfregaço e corar pelo método de Gram. Quando for verificada a presença de bastonetes retos com extremidades arredondadas, Gram-positivos, realizar a prova de fermentação tempestuosa.
5.6.2 Fermentação tempestuosa (storm test): Transferir 1 mL da cultura fresca obtida no meio tioglicolato ou no caldo de carne cozida para um tubo contendo meio leite com ferro. Adicionar o selo estéril e incubar a 46 ± 1ºC em banho-maria por 6 horas (reincubar por maior tempo (12 a 18 h) quando o controle positivo não apresentar reação claramente positiva).
Alternativamente, pode ser utilizada uma suspensão da cultura em teste, obtida pela lavagem da superfície do ágar estoque com solução salina peptonada 0,1%, transferindo 1 mL desta para o meio leite com ferro. O Clostridium perfringens geralmente coagula o leite em até 6 horas a 46ºC, com formação de coágulo firme e grande quantidade de gás (“fermentação tempestuosa”).
A partir das culturas que se apresentaram como C.perfringens na coloração de Gram e ofereceram resultado positivo na prova de fermentação tempestuosa, realizar as seguintes provas:
5.6.3 Prova da motilidade Inocular a cultura, com agulha, em ágar motilidade-nitrato tamponado.
Incubar em anaerobiose a 36 ± 1ºC por 24 horas.
O Clostridium perfringens é imóvel, com crescimento apenas ao longo da linha de inoculação.
5.6.4 Prova da redução do nitrato: Após a leitura da motilidade, acrescentar ao ágar 0,5 a 1 mL de solução de alfa-naftilamina 0,5% e 0,5 a 1 mL de ácido sulfanílico 0,8%.
O aparecimento de coloração vermelha indicará a redução do nitrato a nitrito.
Para confirmação do resultado negativo, acrescentar alguns miligramas de pó de zinco.
O aparecimento de uma cor rosa será indicativo da não redução do nitrato, enquanto que a não alteração de cor será indicativa de reação positiva para redução do nitrato.
O Clostridium perfringens reduz nitrato a nitrito.
5.6.5 Fermentação da lactose e liquefação da gelatina: Inocular a cultura, com agulha, em vários pontos do meio lactose-gelatina.
Se o meio for utilizado 8 ou mais horas após a sua preparação, regenerá-lo por aquecimento a 50ºC por 2 horas em banhomaria, antes da inoculação.
Incubar em anaerobiose a 36 ± 1ºC por 44 ± 2h. Após a incubação, manter os tubos em geladeira por 1 hora.
Observar a fermentação da lactose pela produção de bolhas de gás e pela mudança da cor do meio de vermelho para amarelo e também a liquefação da gelatina por meio da permanência do estado líquido após o resfriamento por cerca de 1 hora em geladeira.
O Clostridium perfringens fermenta a lactose e liquefaz a gelatina em 44 ± 2h a 36 ± 1ºC.
5.6.6 Fermentação da rafinose: Repicar a cultura para tubo contendo caldo para fermentação da rafinose.
Após inoculação, adicionar 1 a 2 mL de selo estéril: vaspar ou vaselina ou parafina líquida ou óleo mineral. Incubar a 36 ± 1ºC por 72 ± 2h.
Verificar a fermentação da rafinose pela viragem da cor do indicador vermelho de fenol para amarelo.
As provas de liquefação da gelatina em 44 ± 2h horas e a fermentação da rafinose em 72 ± 2h tornam possível a diferenciação entre Clostridium perfringens e outros clostrídios imóveis e redutores de nitrato como o Clostridium celatum, Clostridium sardiniense e Clostridium paraperfringens.
O Clostridium perfringens fermenta a rafinose dentro de 72 ± 2h.
CARACTERÍSTICAS DIFERENCIAIS DE CLOSTRÍDIOS
Espécies de Clostridium Meio motilidade nitrato Meio lactose-gelatina
Motilidade Nitrato Ácido/ gás Liquefação.gelatina
C.perfringens A - + AG/T + (48h)
C.perfringens B - + AG/T + (48/72h)
C.absonum + + AG/CS -*
C.baratii - + AG/CS -
C. celatum - + AG/CS -
C.paraperfringens - + AG/CS -
C.sardiniense ± ± AG/CS -*
A = ácido; AG = ácido e gás; T = turbidez; CS = claro com sedimento celular; + = positiva; - = negativa; (+) = fraco; ± = motilidade fraca; * = hidrólise lenta da gelatina
6. RESULTADOS
6.1 Cálculo do número de Clostridium sulfito redutores presentes
na amostra:
Calcular o número de Clostridium sulfito redutores multiplicando o número de colônias negras contadas no ágar TSC ou no ágar SFP pelo fator de diluição usado, conforme recomendações constantes do Anexo IV, “Procedimentos para contagem de colônias”, deste Manual.
6.2 Cálculo do número de Clostridium perfringens: Considerar como Clostridium perfringens as colônias que se apresentarem, na coloração de Gram, como bastonetes Gram positivos, retos, com extremidades arredondadas, positivos para a prova de fermentação tempestuosa, imóveis, redutores de nitrato, fermentadores da lactose em 44 ± 2h, da rafinose em até 72 ± 2h e capazes de hidrolizar a gelatina em 44 ± 2h.
A partir dos dados obtidos, calcular o número de microrganismos presentes, de acordo com o Anexo IV, “Procedimentos para a contagem de colônias”, deste Manual.
Expressar o resultado em UFC/g.
7. BIBLIOGRAFIA CONSULTADA
RHODEHAMEL, E.J.; HARMON, S.M. Clostridium perfringens. In: Bacteriological Analytical Manual Online. 2001. Disponível em: http://www.cfsan.fda.gov.
LABBE, R.G. Clostridium perfringens. In: Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods, 4. ed. Washington DC. American Public Health Association. Frances Pouch Downes & Keith Ito (Eds.), 2001. p.325-330.
MacFADDIN, J.F. Media for isolation-cultivation-identification-maintenance of medical bacteria. Williams & Wilkins, Baltimore, USA, 1985. 928p. MacFADDIN, J.F. Biochemical Tests for Identification of Medical Bacteria. Lippincott Williams& Wilkins, Baltimore, USA, 2000. 912p.
