NÚMERO MAIS PROVÁVEL (NMP) DE MICRORGANISMOS MESÓFILOS AERÓBIOS VIÁVEIS CAPAZES DE CAUSAR ALTERAÇÃO EM PRODUTOS LÁCTEOS UHT E ESTERILIZADOS, PASTOSOS E VISCOSOS
BRASIL. Instrução Normativa n°. 62 de 26 de agosto de 2003. Análises microbiológicas para controle de produção de origem animal e água. Diário Oficial da União, Brasília, 18 set. 2003.
1.OBJETIVOS E ALCANCE
Estabelecer procedimento para a determinação do NMP de microrganismos mesófilos aeróbios viáveis, com exclusão daqueles comprovadamente não patogênicos e não causadores de alterações físicas, químicas e organolépticas em produtos lácteos pastosos e viscosos.
Detectar a presença de Bacillus sporothermodurans para diferenciá-lo dos demais microrganismos mesófilos aeróbios viáveis.
Aplica-se a amostras de creme de leite e outros produtos pastosos e viscosos tratados pelo processo UHT e produtos esterilizados.
2. FUNDAMENTOS
2.1 Pré-incubação: Baseia-se na incubação das amostras em estufa a 36 ± 1ºC por 7 dias e posterior verificação da ocorrência de alterações das características do produto.
2.2 Determinação do NMP: Baseia-se na semeadura de diluições seriadas da amostra em tubos contendo caldo cérebro-coração-sal 0,65%-extrato de levedura 0,6% (BHI-SE), seguida de incubação a 30 ± 1ºC por 72 horas, com posterior repique em ágar cérebro-coração (BHI) e ágar nutriente isento de extrato de levedura e a subseqüente identificação da flora presente.
3. REAGENTES E MATERIAIS
Vidraria e demais insumos básicos obrigatórios em laboratórios de microbiologia de alimentos;
Ágar cérebro-coração (ABHI);
Ágar nutriente isento de extrato de levedura;
Ágar esculina;
Ágar uréia;
Caldo cérebro-coração nitrato (BHI-NO3);
Caldo cérebro-coração-sal 0,65%-extrato de levedura 0,6% (BHI-SE);
Caldo cérebro-coração-sal 0,65%-extrato de levedura 0,6% concentração dupla (BHI-SE2);
Caldo vermelho de fenol com glicose;
Solução salina peptonada 0,1%;
Reativo para oxidase (N'N'N'N'-tetrametil-parafenileno-diamina ou oxalato de para-amino-dimetilanilina) ou tiras para teste de oxidase;
Peróxido de hidrogênio 3%;
Alfa-naftilamina 0,5%;
Ácido sulfanílico 0,8%;
Zinco em pó;
Etanol 70% ou Etanol 70º GL;
Reagentes para coloração de Gram.
4. EQUIPAMENTOS
Equipamentos básicos obrigatórios em laboratórios de microbiologia de alimentos.
5. PROCEDIMENTOS
5.1 Preparo da amostra: Após pré-incubação, as amostras visualmente inalteradas devem ser agitadas por 25 vezes. Antes da abertura, desinfetar externamente as embalagens com solução desinfetante e posteriormente com etanol 70% ou etanol 70º GL. Deixar secar.
Pesar 25 ± 0,2 g ou pipetar 25 ± 0,2 mL da amostra de acordo com as instruções contidas no Anexo V, “Procedimentos para o preparo, pesagem e descarte de amostras”, deste Manual.
Adicionar 225 mL de solução salina peptonada 0,1%.
A partir da diluição inicial 10-1, efetuar as diluições desejadas de acordo com o Anexo II, “Diluições e soluções”, deste Manual.
5.2 Procedimentos de controle: Aplicar os procedimentos de controle específicos estabelecidos pelo laboratório.
5.3 Inoculação: Inocular 10 mL da diluição 10-1, 1 mL da diluição 10-1 e 1 mL da diluição 102, separadamente, em três séries de três tubos contendo 10 mL de BHI-SE. Na primeira série de tubos, que foram inoculados com 10 mL da diluição 10-1, usar o meio com concentração dupla (BHI-SE2).
Incubar a 30 ± 1°C por 72 horas.
5.4 Confirmação do crescimento: Finalizado o período de incubação, repicar todos os tubos sobre a superfície seca de ABHI e de ágar nutriente isento de extrato de levedura, estriando de forma a obter colônias isoladas.
Incubar a 30 ± 1ºC por até 72 horas.
5.5 Leitura: O crescimento nas placas será indicativo de presença de mesófilos aeróbios no tubo de origem, porém será necessária a diferenciação entre Bacillus sporothermodurans (que não é patogênico nem produz alteração do produto) e outros mesófilos aeróbios capazes de alterar o alimento. Registrar o número de tubos que apresentaram crescimento de colônias nas placas correspondentes, registrando em separado as colônias suspeitas de Bacillus sporothermodurans.
Quando o crescimento bacteriano for devido à presença de esporos de Bacillus sporothermodurans na amostra em análise, será observado crescimento abundante de colônias lisas, de forma regular, com coloração entre branco e bege, com diâmetro máximo de 3 mm, facilmente identificáveis, nas placas com ABHI.
No ágar nutriente isento de extrato de levedura, o Bacillus sporothermodurans comumente não forma colônias visíveis, porém poderão se desenvolver colônias puntiformes de coloração entre branco e bege.
Selecionar de 2 a 3 colônias correspondentes a cada um dos tubos positivos e repicar para tubos com ABHI inclinado.
Incubar a 36 ± 1ºC por até 72 horas e realizar os seguintes testes confirmatórios:
5.6 Coloração de Gram: Preparar esfregaço das colônias suspeitas e corar pelo método de Gram .
Quando forem observados bastonetes Gram positivos, realizar a prova da catalase conforme o item 5.7.
Quando forem observados microrganismos com morfologia e características diferentes de bastonetes Gram positivos, considerar o tubo correspondente como positivo para presença de aeróbios mesófilos.
5.7 Catalase: Com auxílio de alça de platina, palito de madeira, bastão de vidro ou Pipeta de Pasteur, estéreis, transferir a cultura para uma lâmina ou placa de vidro contendo uma gota de peróxido de hidrogênio 3%. Misturar o inóculo ao peróxido e observar a reação.
A não formação de borbulhas indica prova negativa para catalase. A formação de borbulhas indica prova positiva para catalase.
A maioria dos membros do gênero Bacillus apresenta reação de catalase positiva.
Quando a coloração de Gram demonstrar a presença de bastonetes Gram positivos e a prova da catalase for positiva para a cultura em teste, proceder à confirmação da presença de Bacillus sporothermodurans por meio das provas da oxidase, hidrólise da esculina, fermentação da glicose, redução do nitrato, produção de urease e crescimento em anaerobiose, conforme abaixo descrito.
5.8 Oxidase: Usando alça de platina, Pipeta de Pasteur, palitos de madeira ou de plástico descartáveis, estéreis, realizar a prova da oxidase, espalhando a cultura sobre papel filtro impregnado com o reativo ou sobre tiras de papel com reativo para oxidase, comercialmente disponíveis.
Fazer a leitura em 10 a 20 segundos. Após esse tempo, reações falso positivas podem ocorrer.
O aparecimento de cor azul (N'N'N'N'-tetrametil-parafenileno-diamina) ou vermelho intenso (oxalato de para-amino-dimetilanilina) é indicativo de reação positiva.
Não utilizar alças de níquel-cromo ou alças de aço inoxidável para realizar a prova de oxidase pois traços de óxido de ferro na superfície flambada pode produzir reação falso positiva.
O Bacillus sporothermodurans apresenta reação de oxidase positiva.
5.9 Crescimento em anaerobiose: Inocular a cultura em tubos de ABHI inclinados e incubar em jarra de anaerobiose a 36 ± 1ºC por 72h.
O Bacillus sporothermodurans não cresce em anaerobiose.
5.10 Hidrólise da esculina”Inocular a cultura, com agulha, em tubos contendo agar esculina inclinado.
Incubar a 36 ± 1ºC por até 72 horas.
A hidrólise da esculina é evidenciada pelo enegrecimento do meio.
O Bacillus sporothermodurans hidrolisa a esculina.
5.11 Fermentação da glicose: Semear tubos de caldo vermelho de fenol-base adicionados de glicose.
Incubar a 36 ± 1ºC por até 72 horas.
A viragem de cor do indicador vermelho de fenol para amarelo indica a fermentação do açúcar presente.
O Bacillus sporothermodurans não fermenta a glicose.
5.12 Redução de nitrato: Inocular a cultura, com alça, em tubos contendo caldo BHINO3.
Incubar a 36 ± 1ºC por 72 horas.
Após incubação, adicionar aos tubos 0,5 a 1 mL de alfa naftilamina 0,5%, e 0,5 a 1 mL de ácido sulfanílico 0,8%.
O aparecimento de coloração rosa indica positividade para redução de nitrato.
Quando não houver desenvolvimento de coloração, adicionar ao tubo alguns miligramas de pó de zinco. Nesta situação, o aparecimento de coloração rosa indica reação negativa enquanto que o não desenvolvimento de cor indica positividade.
O Bacillus sporothermodurans não reduz o nitrato à nitrito.
5.13 Prova da urease: Inocular com alça a superfície de placas ou tubos com agar uréia previamente preparadas.
Incubar a 36 ± 1ºC por até 72 horas.
Observar o crescimento com mudança de coloração para rosa intenso, o que indica positividade para produção de urease.
O Bacillus sporothermodurans não produz urease.
6. RESULTADOS
Considerar positivos os tubos que apresentaram crescimento de outras bactérias diferentes do Bacillus sporothermodurans e considerar como negativo quando não for observado crescimento de colônias nas placas e quando o crescimento observado for confirmado como sendo somente de Bacillus sporothermodurans.
A partir dos resultados obtidos, consultando a tabela de NMP apropriada e seguindo as instruções contidas no Anexo III, “Procedimentos básicos de contagem”, deste Manual, calcular o número mais provável de microrganismos mesófilos aeróbios viáveis presentes na amostra em análise.
Quando for confirmada a presença de Bacillus sporothermodurans juntamente com outros mesófilos na amostra, deverão ser excluídos os tubos que continham apenas Bacillus sporothermodurans para o cálculo final do NMP de microrganismos mesófilos aeróbios viáveis.
Quando for observada somente a presença de colônias de Bacillus sporothermodurans na amostra, reportar o resultado de mesófilos aeróbios viáveis como <0,3 NMP/mL. Sempre que for observada a presença de Bacillus sporothermodurans, fazer constar no Certificado Oficial de Análise (COA), no campo “OBS”., a expressão: “Presença de Bacillus sporothermodurans”.
Deverão ainda acompanhar o resultado de análise informações adicionais sobre o tipo de microrganismo encontrado (como por exemplo: cocos Gram positivos, bastonetes Gram negativos, flora mista, etc.) ou o(s) microrganismo(s) aeróbio(s) presente(s), quando identificado(s).
Os resultados da análise de NMP de microrganismos mesófilos aeróbios viáveis a 30ºC por 72 horas em produtos lácteos UHT e esterilizados, pastosos e viscosos, devem ser expressos em: NMP/g.
O resultado da análise de pré-incubação a 36ºC por 7 dias deve ser expresso como “alterado” ou “sem alteração”.
7. BIBLIOGRAFIA CONSULTADA
BRASIL. Ministério da Agricultura do Abastecimento e da Reforma Agrária. Secretaria de Defesa Agropecuária. Departamento de Defesa Animal. Manual de métodos microbiológicos para alimentos. Coordenação Geral de Laboratório Animal. 1991/1992 2ª revisão. 136p.
PETTERSSON, B.; LEMBKE, F.; HAMMER, P.; STACKEBRANDT, E.; PRIEST, F.G. Bacillus sporothermodurans, a new species producing highly-heat-resistant endospores. International Journal of Systematic Bacteriology, 1996. P. 759-764.
MORTON, R.D. Aerobic Plate Count.In: Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods, 4. ed. Washington DC. American Public Health Association. Frances Pouch Downes & Keith Ito (Eds.), 2001. p.63-67.
