PESQUISA DE Listeria monocytogenes
BRASIL. Instrução Normativa n°. 62 de 26 de agosto de 2003. Análises microbiológicas para controle de produção de origem animal e água. Diário Oficial da União, Brasília, 18 set. 2003.
1. OBJETIVOS E ALCANCE
Estabelecer método analítico para a detecção de Listeria monocytogenes em alimentos de origem animal.
A metodologia aplica-se a todos os alimentos cárneos e lácteos.
2. FUNDAMENTOS
2.1 Enriquecimento Seletivo: O enriquecimento seletivo, realizado em duas etapas (a primeira em caldo UVM, e a segunda em caldo Fraser), tem a finalidade de inibir a flora acompanhante, permitindo a recuperação de baixos números de células de Listeria sp.
O efeito seletivo no caldo UVM é exercido pela associação de ácido nalidíxico e acriflavina e no caldo Fraser pelo cloreto de lítio, ácido nalidíxico e acriflavina.
2.2 Seleção e Isolamento: Nos produtos cárneos, a seleção se realiza em dois meios sólidos: ágar triptose com ácido nalidíxico (ATN) e ágar Palcam (AP), enquanto que nos produtos lácteos esta se realiza em agar Oxford (AO), ágar Palcam (AP) e ágar triptose com ácido nalidíxico (ATN).
As substâncias impedientes presentes nos meios sólidos são ácido nalidíxico no ATN, sulfato de polimixina B, acriflavina, cloreto de lítio e ceftazidina no AP, e cloreto de lítio, acriflavina, sulfato de colistina, cefotetan, cicloheximide e fosfomicina no AO.
A seleção no ATN baseia-se nas características das colônias, quando observadas sob luz oblíqua, em estereoscópio. No AP, observa-se a não fermentação do manitol e a formação de esculetina pela hidrólise da esculina, reação revelada pela presença de ferro trivalente. No AO, as colônias de Listeria sp apresentam-se pretas, rodeadas por halo negro devido à hidrólise da esculina.
2.3 Confirmação da presença de Listeria sp: A confirmação bioquímica de Listeria sp realiza-se por meio da verificação da produção de catalase, observação das características morfológicas e tintoriais, verificação do crescimento típico em meio semi-sólido e, adicionalmente, por meio da verificação da incapacidade de redução de nitrato e verificação da positividade nas reações de Vermelho de Metila e Voges Proskauer (VM-VP).
2.4 Identificação de Listeria monocytogenes: A diferenciação das espécies de Listeria sp realiza-se por meio da verificação da produção de â-hemólise em ágar sangue de cobaio ou ágar sangue de carneiro, verificação da capacidade de produzir reação de CAMP positiva com S. aureus (e opcionalmente também com Rodococcus equi), e verificação da capacidade de fermentação dos carbohidratos ramnose, xilose e manitol. A utilização concomitante de culturas de R. equi e S. aureus no CAMP teste é útil para a diferenciação de L. ivanovii, que apresenta reação de CAMP forte com R. equi (em forma de flecha). Quando se julgar conveniente, a identificação poderá ser realizada por meio de um sistema comercialmente disponível de testes bioquímicos miniaturizados padronizados, conjuntamente com a prova de â-hemólise ou CAMP teste.
3. REAGENTES E MATERIAIS
Vidraria e demais insumos básicos obrigatórios em laboratórios de microbiologia de alimentos;
Caldo Fraser - base;
Caldo de enriquecimento para Listeria (UVM) ou opcionalmente
Caldo para Enriquecimento de Listeria (LEB);
Caldo VM-VP;
Caldo vermelho de fenol - base ou Ágar para fermentação de carbohidratos - base;
Ágar Palcam (AP);
Ágar Columbia com ácido nalidíxico - base;
Ágar triptose com ácido nalidíxico (ATN);
Ágar Oxford (AO) - base;
Ágar motilidade;
S. aureus ATCC 25923 para CAMP teste;
Rodococcus equi ATCC 6939 para CAMP teste (opcional);
Sistema miniaturizado para identificação bioquímica de Listeria (opcional);
Ácido nalidíxico 1%;
Acriflavina cloridrato 1%;
Peróxido de hidrogênio 3%;
Vermelho de metila 0,06%;
Alfa-naftol 5%;
Hidróxido de potássio 40%;
Ácido sulfanílico 0,8%;
Alfa-naftilamina 0,5%;
Suplemento para caldo UVM (ácido nalidíxico 20mg/L; acriflavina 12mg/L);
Suplemento para caldo LEB (acriflavina 12mg/L);
Suplemento para ágar Oxford (cicloheximide 200mg/0,5L; sulfato de colistina 10,0mg/0,5L; acriflavina 2,5mg/0,5L; Cefotetan 1,0mg/0,5L; fosfomicina 5,0mg/0,5L);
Suplemento para ágar Palcam (polimixina B 5,0mg/0,5L; acriflavina 2,5mg/0,5L; Ceftazidime 10,0mg/0,5L);
Suplemento para caldo Fraser (citrato de amônio e ferro III 250mg/0,5L; acriflavina 12,5mg/0,5L; ácido nalidíxico 10mg/0,5L);
Pó de Zinco;
Xilose solução aquosa 5%;
Manitol solução aquosa10%;
Ramnose solução aquosa 5%;
Sangue desfibrinado de carneiro;
Sangue desfibrinado de cobaio .
OBS: Os suplementos podem ser adquiridos em forma de vial (comercialmente disponível), necessitando apenas a suspensão em diluente antes de seu uso. Verificar sempre a composição, comparando com aquela indicada nesta metodologia.
4. EQUIPAMENTOS
Equipamentos básicos obrigatórios em laboratórios de microbiologia de alimentos.
Estereoscópio com iluminação em ângulo de 45º.
5. PROCEDIMENTOS
5.1 Preparo da Amostra: Acrescentar à alíquota de 25 ± 0,2 g ou mL da amostra preparada conforme Anexo V, 225 mL de caldo UVM adicionado de seu suplemento.
OBS: Verificar a formulação do Caldo UVM ou LEB. Algumas marcas de caldo UVM já contêm em sua formulação ácido nalidíxico e acriflavina. O caldo LEB já contém ácido nalidíxico, bastando a suplementação com 0,25 mL de solução 1% de acriflavina.
5.2 Procedimentos de controle: Aplicar os procedimentos de controle específicos estabelecidos pelo laboratório.
5.3 Primeiro enriquecimento seletivo: Homogeneizar as alíquotas preparadas conforme item 5.1 e incubar a 30 ± 1ºC por 24 horas.
5.4 Segundo enriquecimento seletivo.: Após a incubação, transferir 0,1 mL da cultura para tubo contendo 10mL de caldo Fraser suplementando-o, se necessário, com 0,1 mL do vial diluído conforme a indicação do fabricante.
OBS:Alguns fabricantes de caldo Fraser fornecem o meio já pronto para o uso; outros fornecem o meio adicionado de ácido nalidíxico e de acriflavina, bastando a suplementação com citrato de amônio e ferro III (0,1 mL de solução a 5% equivalente a 250 mg/0,5L de meio).
Incubar a 30 ± 1ºC por 24 a 48 horas.
5.5 Isolamento
5.5.1 Amostras de produtos cárneos: Utilizando alça de platina de 5 mm de diâmetro, repicar do caldo Fraser para placas contendo ATN e placas contendo AP suplementado, sendo que as placas devem estar com as superfícies secas, de forma a proporcionar a obtenção de colônias isoladas. Opcionalmente, pode ser usado o ATNS em paralelo com os meios ATN e AP.
Incubar as placas de ATN a 30 ± 1ºC por 24 horas e as placas de AP e ATNS, na mesma temperatura, por 24 a 48 horas.
5.5.2 Amostras de produtos lácteos: Utilizando alça de platina de 5 mm de diâmetro, repicar do caldo Fraser para placas contendo AO suplementado e placas contendo AP suplementado, sendo que as placas devem estar com as superfícies secas, de forma a proporcionar a obtenção de colônias isoladas.
Incubar as placas de ATN a 30 ± 1ºC por 24 horas e as placas de AP na mesma temperatura, por 24 a 48 horas.
5.6 Seleção; Com auxílio de lupa ou estereoscópio com iluminação angular de 45º, selecionar 3 a 5 colônias de cor azulada ou azulacinzentada em ATN.
Selecionar, com o auxílio de conta-colônias ou de estereoscópio com iluminação normal, colônias pretas rodeadas por halo escuro em AO.
Selecionar, com o auxílio de conta-colônias ou de estereoscópio com iluminação normal, colônias verde-amareladas rodeadas por zona escura, ou colônias verde-acinzentadas, em AP.
5.7 Confirmação da presença de Listeria sp: Repicar o mesmo inóculo para tubos com ágar estoque inclinado e para placas contendo ATN. Incubar a 30 ± 1ºC por 24 horas.
Verificar a pureza das culturas no ATN. Utilizar as culturas do ágar estoque para a realização das provas de confirmação e identificação.
5.7.1 Prova da catalase
Em uma placa de Petri, depositar 1 gota de peróxido de hidrogênio 3%. Com auxílio de alça de platina, bastão de vidro, palito de madeira ou pipeta de Pasteur, retirar uma alíquota do cultivo e misturar com a gota do reagente. A presença de catalase se traduz por desprendimento de borbulhas de oxigênio (catalase positiva). Das culturas catalase positivas, fazer um esfregaço para coloração de Gram.
5.7.2 Coloração de Gram: A Listeria sp se apresenta como bastonete curto ou na forma de cocobacilo, Gram positivo.
5.7.3 Prova da motilidade típica: Inocular uma alíquota da cultura em ágar motilidade, com agulha, por picada. Incubar em estufa de B.O.D. (Demanda Biológica de Oxigênio) a 22-25°C por 2 a 5 dias. Após incubação, verificar o tipo de crescimento.
A Listeria sp apresenta crescimento móvel característico em forma de guarda-chuva.
5.7.4 Prova de Redução de Nitrato: Após a leitura da motilidade, adicionar a cada tubo 2 a 3 gotas de alfa-naftilamina 0,5% e 2 a 3 gotas de ácido sulfanílico a 0,8%.
O aparecimento de coloração rosa indica positividade.
Quando não houver desenvolvimento de coloração, adicionar ao meio alguns miligramas de pó de zinco. Nesse caso, o aparecimento de coloração rosa indica reação negativa e a não alteração de cor indica positividade.
As culturas de Listeria sp não reduzem o nitrato.
5.7.5 Prova de VM-VP: Inocular tubos com caldo VM-VP e incubar a 36 ± 1ºC, por 5 dias.
Após a incubação, pipetar alíquotas de 5 e 1 mL da cultura para dois tubos estéreis.
No tubo contendo 5 mL adicionar 2 a 3 gotas de solução de vermelho de metila a 0,06%.
O aparecimento da cor vermelha indica reação VM positiva.
No tubo contendo 1 mL, adicionar 0,6 mL de alfa-naftol solução alcoólica 5% e 0,2 mL de hidróxido de potássio solução aquosa 40% (nesta ordem) e agitar.
Deixar em repouso por 1 a 2 horas. O aparecimento da cor vermelha escura indica reação VP positiva.
As culturas de Listeria sp apresentam reações VM e VP positivas.
5.8 Identificação de Listeria monocytogenes: As culturas que tenham confirmado as características do gênero Listeria deverão ser testadas para diferenciação entre Listeria monocytogenes e outras espécies por meio das seguintes provas bioquímicas:
5.8.1 Produção de â-hemólise: Sobre a superfície seca de ágar sangue desfibrinado de cobaio ou carneiro (ACNS), estriar o inóculo com alça ou semear com agulha, por picada. Incubar a 36 ± 1ºC por 24 a 48 horas.
A reação positiva se traduz pelo aparecimento de zona clara transparente (â-hemólise) ao redor das colônias.
As culturas de Listeria monocytogenes, Listeria ivanovii e Listeria seeligeri são â-hemolíticas.
OBS: A utilização de sangue de cobaio desfibrinado nesta prova oferece a vantagem de zonas de hemólise mais claras, especialmente com culturas de L.monocytogenes fracamente hemolíticas.
5.8.2 CAMP teste: Em ágar Columbia com ácido nalidíxico adicionado de 5% de sangue de carneiro desfibrinado (CNAS), com auxílio de agulha ou alça de 1 ìL, traçar uma linha perpendicular à linha previamente semeada com S. aureus. Tomar o cuidado para que as linhas não se toquem.
Incubar a 36 ± 1ºC por 72 horas, em atmosfera de 2 a 5% de dióxido de carbono (CO2).
As culturas de Listeria monocytogenes e Listeria seeligeri produzem zona clara de hemólise total acentuada próximo à linha de crescimento do Staphylococcus aureus.
Opcionalmente, este teste pode ser feito com S. aureus e R. equi. Nesse caso, traçar na placa de CNAS uma linha vertical com inóculo de S. aureus e outra com R. equi, distantes alguns centímetros entre si. Semear as culturas teste em linhas horizontais entre as linhas de S. aureus e R. equi, mantendo distância de cerca de 1,5 cm entre as linhas e cuidando que estas não toquem as linhas de S. aureus e R. equi.
Incubar a 36 ± 1ºC por 72 horas, em atmosfera de 2 a 5% de dióxido de carbono (CO2).
Após a incubação, examinar as placas para verificação de hemólise na zona de interação, próximo às linhas verticais. A atividade hemolítica de L. monocytogenes e L. seeligeri se apresenta aumentada próximo a linha de crescimento do S. aureus. As demais listerias apresentam reação de CAMP negativa com o S. aureus. A reação de CAMP produzida pela L. ivanovii com R. equi se caracteriza por ser mais intensa e se apresentar em forma de flecha. As L. innocua, L. welshimeri e L. grayi são não-hemolíticas e não apresentam reação de CAMP positiva com o S. aureus nem com o R. equi.
O CAMP teste diferencia L. ivanovii de L. seeligeri e pode diferenciar uma L. seeligeri, fracamente hemolítica, de L. welshimeri. Isolados que dão reações típicas para L. monocytogenes, exceto para a produção de hemolisina, devem ser testadas para CAMP antes de serem identificadas como L. innocua (não hemolítica).
A maioria dos isolados de L. monocytogenes produz também uma zona de intensificação da hemólise junto à linha de crescimento do R. equi.
5.8.3 Fermentação de carbohidratos: Inocular 3 tubos com caldo vermelho de fenol-base, adicionados respectivamente, de xilose, manitol e ramnose.
Incubar a 30 ± 1ºC por 36 horas. A viragem de cor do indicador vermelho de fenol para amarelo indica a fermentação do açúcar presente. Alternativamente, esta prova pode ser realizada inoculando as culturas com agulha (em apenas um ponto) em 3 placas de ágar para fermentação de carbohidratos adicionado de xilose, manitol e ramnose, respectivamente. A viragem de cor do indicador púrpura de bromocresol (azul) para amarelo indica a fermentação do açúcar presente.
As reações típicas das diversas Listeria sp estão representadas no quadro abaixo:
LM LIVA LINN LW LS LG
â-hemólise + + - - + -
Red-NO3 - - - - - -
CAMP Teste-SA + - - - + -
CAMP Teste-RE V + - - - -
Manitol - - - - - +
Ramnose + - V V - -
Xilose - + - + + -
VM + + + + + +
Gram + + + + + +
V= variável AS = S.aureus RE = R.equi
LM = L. monocytogenes; LIVA = L. ivanovii; LINN = L. innocua; LW = L.welshimeri;
LS = L.seeligeri; LG = L. grayi
6. RESULTADOS
6.1 Interpretação: Considerar como Listeria monocytogenes as culturas que apresentarem reações típicas nas provas bioquímicas.
6.2 Expressão dos resultados:
Expressar o resultado como:
Pesquisa de Listeria monocytogenes: Presença/25 g ou mL; ou
Pesquisa de Listeria monocytogenes: Ausência/25 g ou mL
Nota: sempre que as análises laboratoriais demonstrarem a presença de outras espécies de Listeria, da área reservada a observações, do Certificado Oficial de Análise, deverá constar: Presença de Listeria, seguida do nome da espécie encontrada. Por exemplo:
Presença de Listeria innocua, Presença de Listeria welshimeri ou outra.
7. BIBLIOGRAFIA CONSULTADA
BENNETT , R.W.; WEAVER, R.E. Seradiagnosis of Listeria monocytogenes. In: AOAC International. Bacterial Analytical Manual. 8. ed. Gaithersburg. Food and Drug Administration, 1995. p.11.01-11.08.
RYSER, E.T.; DONNELLY, C.W. Listeria. In: Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods. 4 ed. Frances Pouch Downes & Keith Ito (Eds.), Washington: American Public Health Association, 2001. p.63-67.
HITCHINS A.D. Listeria monocytogenes . In: Bacteriological Analytical Manual Online. 2001. Disponivel em: http://www.cfsan.fda.gov
MacFADDIN, J.F. Media for isolation - Cultivation - Identification-Maintenance of Medical Bacteria. John Buttler (Ed.) William & Wilkins. Baltimore. 1985.
