PESQUISA DE Salmonella
BRASIL. Instrução Normativa n°. 62 de 26 de agosto de 2003. Análises microbiológicas para controle de produção de origem animal e água. Diário Oficial da União, Brasília, 18 set. 2003.
1. OBJETIVOS E ALCANCE
Estabelecer metodologia analítica para a detecção de Salmonella sp em amostras de alimentos, rações e ingredientes.
Aplica-se a amostras de alimentos de origem animal, rações e ingredientes.
2. FUNDAMENTOS
2.1 Pré-enriquecimento: Baseia-se na incubação, a 36 ± 1ºC por 16 a 20 horas, de 25 ± 0,2 g ou 25 ± 0,2 mL da amostra, adicionada de 225 mL do diluente específico para cada caso, estabelecido no item 5.1. Esse procedimento visa minimizar os efeitos do processamento industrial dos alimentos, capaz de promover estresse nas células de Salmonella, sem inativá-las biologicamente.
Quando é utilizada solução salina peptonada tamponada, esta avorece a manutenção do pH, evitando que as bactérias acompanhantes acidifiquem o meio, prejudicando a recuperação das células de Salmonella.
Para leite em pó, segundo o FDA, o diluente utilizado é água destilada estéril adicionada de solução de verde brilhante, o que visa inibir o crescimento de bactérias Gram positivas.
2.2 Enriquecimento seletivo: Baseia-se na utilização de meios que contêm substâncias de ação impediente do crescimento para a maioria dos microrganismos interferentes e na incubação em temperatura seletiva.
O enriquecimento seletivo de Salmonella se faz obrigatoriamente nos meios líquidos seletivos, caldo Rappaport Vassiliadis e caldo selenito-cistina.
Adicionalmente, utiliza-se o caldo tetrationato.
No caldo Rappaport Vassiliadis, a presença de verde malaquita e de cloreto de magnésio, associada à temperatura de 41 ± 0,5ºC por 24 a 30 horas, atua como agentes seletivos da microbiota acompanhante, enquanto a presença de peptona de farinha de soja estimula o crescimento de Salmonella.
No caldo selenito-cistina, o agente inibidor selenito de sódio atua inibindo os coliformes e enterococos. Esse meio é incubado a 41 ± 0,5ºC por 24 a 30 horas.
No caldo tetrationato, a seletividade é conferida pelo tetrationato e pelo verde brilhante.
2.3 Isolamento e seleção: Baseia-se na seleção de colônias de Salmonella em, pelo menos, dois meios sólidos: o ágar verde brilhante vermelho de fenol lactose sacarose (BPLS) obrigatoriamente e outro ágar de maior impediência escolhido pelo laboratório.
No ágar verde brilhante, a novobiocina adicionada visa principalmente a inibição de Proteus sp. Esse meio apresenta em sua composição bile bovina e um corante derivado do trifenilmetano (verde brilhante), responsáveis pela inibição de microrganismos Gram positivos.
Como meio de maior impediência, utilizar MLCB ou Rambach ou XLD ou XLT4 ou outro.
No ágar Rambach, a diferenciação entre Salmonella e outros microrganismos é promovida pela presença de propilenoglicol, e também de um cromógeno que evidencia a hidrólise da beta-galactosidase.
No ágar MLCB, a concentração de íons Magnésio promove o crescimento de Salmonella. A presença de verde-brilhante inibe a flora acompanhante. Esse ágar não utiliza a fermentação da lactose como sistema de identificação, o que possibilita a detecção de cepas de comportamento atípico no BPLS. A produção de H2S é evidenciada pelo enegrecimento do centro da colônia. Cepas de Salmonella H2S negativas, como Salmonella Sendai, Salmonella Berta, Salmonella Pullorum e Salmonella Seftenberg, podem produzir colônias azuis. É um meio que, associado ao caldo de enriquecimento Rappaport Vassiliadis, tem sua seletividade substancialmente aumentada.
A Salmonella Typhi e a Salmonella Paratyphi não crescem nesse meio devido à presença de verde-brilhante.
2.4 Identificação bioquímica: Baseia-se na evidenciação das propriedades fisiológicas e metabólicas das culturas suspeitas: por meio da verificação da presença de citocromo oxidase; detecção de pirrolidonil peptidase (PYRase) segundo Bennett et. al (1999); produção de urease; fermentação da glicose, sacarose e lactose no meio TSI; detecção de beta-galactosidase; descarboxilação da lisina; produção de H2S; motilidade e produção de indol.
Para confirmação final, em casos de dúvida, realizam-se outras provas complementares, baseadas na inoculação das culturas suspeitas em uma bateria miniaturizada de testes padronizados. Os microtubos contendo substratos desidratados para cada teste são reidratados pela adição da suspensão do microrganismo teste em diluente específico para esta finalidade.
2.5. Prova de soroaglutinação: Baseia-se na reação antígeno-anticorpo, com conseqüente aglutinação do antígeno frente ao anti-soro para Salmonella polivalente “O”.
3. REAGENTES E MATERIAIS
Vidrarias e demais insumos básicos obrigatórios em laboratórios de microbiologia de alimentos; Ágar verde brilhante vermelho de fenol lactose sacarose (BPLS);
Ágar Rambach ou Ágar manitol lisina cristal violeta verde brilhante (MLCB) ou Ágar XLD ou Ágar; XLT4 ou outro; Ágar ferro três açúcares (TSI) ou Ágar Kligler (KIA);
Ágar estoque;
Caldo lisina descarboxilase ou Ágar lisina ferro - (LIA);
Caldo uréia ou ágar uréia;
Ágar fenilalanina;
Caldo selenito cistina;
Caldo Rappaport Vassiliadis;
Caldo tetrationato (adicional);
Caldo VM/VP;
Meio SIM;
Sistema miniaturizado de provas bioquímicas para identificação de enterobactérias;
Solução salina 0,85%;
Solução salina 2%;
Água destilada estéril;
Solução salina peptonada 1% tamponada;
Solução salina peptonada 1% tamponada com 1% Tween 80;
Solução de α-naphtol 5%;
Solução de hidróxido de potássio 40%;
Solução de uréia 40% estéril;
Solução de iodo-iodeto;
Reativo de Kovac's (opcional: reativo de Ehrlich);
Verde brilhante solução aquosa 0,1%;
Cloreto férrico solução aquosa 10%;
Novobiocina solução aquosa 4%;
Soro anti Salmonella polivalente “O”;
Reativo para oxidase (N'N'N'N'-tetrametil-parafenileno-diamina ou oxalato de para-amino-dimetilanilina) ou tiras para teste de oxidase;
Óleo mineral, parafina líquida ou vaspar estéreis;
Reativos para prova da PYRase - Ácido L-piroglutâmico 7- amino 4-metil cumarina (7 AMC) e Dimetilaminocinamaldeído; Tween 80.
4. EQUIPAMENTOS
Equipamentos básicos obrigatórios em laboratórios de microbiologia de alimentos.
Banho-maria com movimentação de água (agitação ou circulação).
5. PROCEDIMENTOS
5.1. Pesagem e preparo da amostra: Pesar 25 ± 0,2 g ou pipetar 25 ± 0,2 mL da amostra, de acordo com as instruções contidas no Anexo V, “Procedimentos para o preparo, pesagem e descarte de amostras", deste Manual.
Adicionar 225 mL de solução salina peptonada 1% tamponada (ver exceções na observação abaixo).
Homogeneizar por aproximadamente 60 segundos no “stomacher”.
Deixar 1 hora em temperatura ambiente.
OBS: Para leite em pó e soro de leite em pó, utilizar como diluente água destilada e adicionar 5 mL de verde brilhante solução aquosa 0,1%.
Para produtos gordurosos (creme e manteiga) utilizar como diluente solução salina peptonada 1% tamponada com 1% de Tween 80.
Para os demais alimentos, utilizar solução salina peptonada 1% tamponada.
5.2 Procedimentos de controle: Aplicar os procedimentos de controle específicos estabelecidos pelo laboratório.
5.3 Pré-enriquecimento: O pré-enriquecimento se realiza por meio da incubação das alíquotas das amostras preparadas conforme item 5.1, a 36 ± 1ºC por, no mínimo, 16 horas e não mais que 20 horas.
5.4 Enriquecimento seletivo: A partir do procedimento de pré-enriquecimento estabelecido em 5.3, inocular, simultaneamente, nos meios líquidos seletivos conforme abaixo:
5.4.1 Inoculação em caldo Rappaport Vassiliadis: Pipetar alíquotas de 0,1 mL das amostras pré-enriquecidas para tubos contendo 10 mL de caldo Rappaport Vassiliadis.
Incubar os tubos a 41 ± 0,5ºC, em banho-maria, preferencialmente com agitação ou circulação contínua de água, por 24 a 30 horas.
5.4.2 Inoculação em caldo selenito cistina: Pipetar alíquotas de 1 mL das amostras pré-enriquecidas e transferir para tubos contendo 10 mL de caldo selenito cistina.
Incubar os tubos a 41 ± 0,5ºC em banho-maria, preferencialmente com agitação ou circulação contínua de água, por 24 a 30 horas.
5.4.3 Inoculação em caldo tetrationato (adicional): Pipetar alíquotas de 1 mL das amostras pré-enriquecidas e transferir para tubos contendo 10 mL de caldo tetrationato.
Incubar os tubos a 41 ± 0,5ºC em banho-maria, preferencialmente com agitação ou circulação contínua de água, por 24 a 30 horas.
5.5 Isolamento: A partir dos caldos seletivos de enriquecimento, repicar sobre a superfície previamente seca de placas com cada meio sólido seletivo, estriando de forma a se obter colônias isoladas. Dessa forma serão obtidas 2 placas de BPLS, uma originária do caldo Rappaport Vassiliadis e outra originária do caldo selenito cistina e 2 placas do segundo meio seletivo utilizado pelo laboratório, obtidas do mesmo modo.
Incubar todas as placas, invertidas, a 36 ± 1ºC por 18 a 24 horas.
5.6 Seleção: Selecionar de 3 a 10 colônias suspeitas por amostra, conforme características descritas em 5.6.1.
5.6.1 Características das colônias típicas ou suspeitas de Salmonella nos diferentes meios sólidos.
Em Ágar BPLS, as colônias apresentam-se incolores ou de cor rosada, entre translúcidas a ligeiramente opacas. Quando rodeadas por microrganismos fermentadores de lactose, podem apresentar-se de cor verde-amarelada.
Em Ágar Rambach, apresentam-se de cor vermelha. Alguns sorovares podem se apresentar com coloração rosa claro, de cor pêssego ou amarelas (cor de gema).
Em ágar MLCB, apresentam-se negras, convexas, lisas e brilhantes, com bordas regulares. As colônias de Salmonella Pullorum e de Salmonella Gallinarum apresentam-se de tamanho pequeno (cerca de 1 mm), de cor azul intensa ou violeta.
5.7 Provas Bioquímicas: As colônias selecionadas devem ser repicadas em ágar não seletivo e incubadas a 36 ± 1ºC por 18 a 24 horas, a fim de verificar sua pureza.
5.7.1 Provas bioquímicas preliminares: Como bateria mínima para identificação de Salmonella, devem ser realizadas as seguintes provas bioquímicas:
5.7.1.1 Produção de urease: Semear maciçamente em caldo ou ágar uréia.
Incubar a 36 ± 1ºC por 24 a 30 horas.
Observar a coloração do meio. A manutenção da cor inicial do meio indica que não ocorreu hidrólise da uréia. A alteração para rosa intenso é indicativa de alcalinização do meio devido à ação da urease sobre a uréia.
Salmonella não produz urease.
5.7.1.2 Reações em ágar TSI ou ágar Kligler (KIA): Inocular o ágar através de picada profunda e estriamento na superfície inclinada do bisel.
Incubar a 36 ± 1ºC por 18 a 24 horas.
No ágar TSI, estão presentes: glicose (1,0 g/L), lactose (10,0 g/L) e sacarose (10,0 g/L). Como a glicose é um monossacarídeo e está em baixa concentração, será rapidamente fermentada anaerobiamente, formando ácido no fundo do tubo, o que torna o meio amarelo pela viragem do indicador vermelho de fenol (todos os membros da família Enterobacteriaceae fermentam a glicose com produção de ácido).
A fermentação aeróbia da glicose, que ocorre na superfície do bisel, resulta em ácido pirúvico, que é posteriormente degradado a CO2 e água.
A grande maioria das salmonelas não fermenta a sacarose e a lactose, não provocando alterações no meio TSI (que contém esses dois açúcares; já no KIA, a sacarose não está presente). Como a fonte de carbono utilizável (glicose) é rapidamente esgotada, a Salmonella passa a degradar aerobiamente o substrato protéico do meio, produzindo amoníaco (NH3), o que confere ao meio um pH alcalino, modificando a coloração do bisel para rosa intenso.
A maioria das salmonelas apresenta no TSI e no KIA as seguintes reações:
Ácido na base, com ou sem produção de gás.
Alcalino ou inalterado no bisel.
Com produção de H2S.
5.7.1.3 Descarboxilação da lisina: Utilizar caldo lisina ou ágar LIA.
Inocular o caldo lisina e adicionar selo estéril (vaspar, vaselina, parafina), visando evitar o contato do meio com o ar e o conseqüente aparecimento de uma falsa alcalinização na superfície do meio por degradação aeróbia do substrato protéico.
Quando usar o ágar, inocular através de picada profunda, estriando na superfície inclinada do bisel.
Incubar a 36 ± 1ºC por 24 a 30 horas.
Observar se ocorreu descarboxilação da lisina pela alcalinização do meio, o que é demonstrado pela não alteração de cor do indicador presente.
A atividade da enzima lisina descarboxilase é dependente do pH, sendo mais ativa em pH abaixo de 5,5.
A acidificação do meio é obtida pela fermentação da glicose presente. Nessa etapa do processo, ocorre a viragem do indicador púrpura de bromocresol, de violeta para amarelo.
É recomendável a inoculação de um tubo controle de caldo base para descarboxilação sem lisina, para comprovação da acidificação pela fermentação da glicose. Esse tubo deve permanecer amarelo até o final do período de incubação.
Na condição anaeróbia, obtida pelo uso da camada de selo (no caldo lisina) ou na base (do LIA), todo o oxigênio não combinado é consumido pelo microrganismo presente, na fase inicial de crescimento.
A descarboxilação da lisina, que ocorre posteriormente, resulta na produção de uma diamina (cadaverina) e CO2, que conferem ao meio características de alcalinidade e nova viragem da cor do indicador, que passa de amarelo para violeta. A diamina cadaverina é estável quando produzida em condições anaeróbias.
A maioria das salmonelas é capaz de produzir lisina descarboxilase.
Quatro por cento das cepas de Salmonella não descarboxilam a lisina.
A Salmonella paratyphi A e alguns outros sorovares não produzem lisina descarboxilase.
5.7.1.4 Meio SIM: Inocular com picada o meio de cultura.
Incubar a 36 ± 1ºC por 24 a 30 horas.
A motilidade é caracterizada pela difusão do crescimento por todo o meio. Se for restrito à linha de semeadura, indica que o microrganismo é imóvel.
A maioria das salmonelas apresenta motilidade positiva. A Salmonella Gallinarum e a Salmonella Pullorum apresentam motilidade negativa.
O meio SIM é o meio mais indicado para a verificação da produção de H2S.
O H2S é um gás incolor produzido pelo microrganismo em teste, pela redução do tiosulfato presente no meio. A revelação da presença de H2S se realiza por meio da reação do H2S com o citrato de ferro e amônio (presente no meio), formando um precipitado negro insolúvel.
Quinze por cento das culturas de Salmonella Choleraesuis e 95% das de Salmonella Paratyphi A não produzem H2S.
A maioria das salmonelas produz H2S .
Quatorze por cento das cepas de Salmonella são H2S negativo.
Após a leitura da motilidade e da produção de H2S, adicionar algumas gotas de reativo de Kovac´s (ou, opcionalmente de reativo de Ehrlich) aos tubos para verificar se houve produção de indol.
A oxidação do triptofano presente no meio SIM leva à formação de três principais compostos: indol, escatol e indolacetato.
A adição do reativo de Kovac´s resulta na formação de um anel vermelho, resultante da reação entre o indol e o dimetilaminobenzaldeído contido nesse reativo.
Quase a totalidade das salmonelas não produz indol. Segundo Weissfeld et al (1994), cerca de 1% das salmonelas produzem indol.
5.7.1.5 Prova da Oxidase: Usando palitos de madeira, de plástico descartáveis ou pipetas Pasteur, estéreis, ou alça de platina, realizar a prova de oxidase espalhando a cultura sobre papel filtro impregnado com o reativo para oxidase, ou sobre tiras de papel para teste de Oxidase, disponíveis comercialmente.
Fazer a leitura em 10 a 20 segundos. Após esse tempo, podem ocorrer reações falso-positivas.
O aparecimento de cor azul (N'N'N'N'-tetrametil-parafenileno-diamina) ou vermelho intenso (oxalato de para-amino-dimetilanilina) é indicativo de reação positiva.
Não utilizar alças de níquel-cromo ou alças de aço para realizar a prova de oxidase, pois traços de óxido de ferro na superfície flambada podem produzir reação falso-positiva.
Todas as salmonelas apresentam reação de oxidase negativa.
5.7.2 Provas bioquímicas complementares opcionais
5.7.2.1 Desaminação da fenilalanina
Inocular a superfície do ágar fenilalanina por estriamento.
Incubar a 36 ± 1ºC por 18 a 24 horas.
Adicionar 2 a 3 gotas de solução de cloreto férrico 10%.
A alteração da coloração da cultura na superfície do bisel para verde indica reação de desaminação da fenilalanina. Salmonella não desamina a fenilalanina.
5.7.2.2 Reação de Voges-Proskauer
Inocular o caldo VM-VP em duplicata.
Incubar um dos tubos a 36 ± 1ºC por, pelo menos, 24 horas.
O outro tubo deve ser incubado a 22 ± 1ºC, por 96 horas.
Adicionar primeiramente 0,6 mL de solução de a-naphtol 5% e, em seguida, 0,2 mL de solução de hidróxido de potássio 40%.
Agitar os tubos para que haja oxigenação do meio.
Aguardar de 10 a 15 minutos.
A alteração da cor para rosa intenso indica reação de VP positiva.
Hafnia alvei apresenta reação positiva a 22 ± 1ºC e resultado variável a 36 ± 1ºC.
Salmonella apresenta reação negativa para VP nas duas temperaturas.
5.7.2.3 Detecção da enzima pirrolidonil peptidase (PYRase)
A partir das culturas em ágar estoque que apresentaram resultados compatíveis com Salmonella, realizar o teste da presença da enzima pirrolidonil peptidase (PYRase). Espalhar a cultura suspeita sobre cartão impregnado com ácido L-piroglutâmico, substrato que será hidrolisado pela PYRase, quando produzido pelo microrganismo teste.
Para revelar a hidrólise do ácido L-piroglutâmico, adicionar sobre o cartão algumas gotas de para-dimetilaminocinamaldeído, o que, nos casos positivos, resultará no desenvolvimento de coloração vermelha.
Esta prova destina-se à diferenciação entre Citrobacter e Salmonella.
Todas as cepas de Citrobacter sp produzem a enzima pirrolidonil peptidase (reação positiva).
Todas as cepas de Escherichia coli e 96% das Salmonella não produzem essa enzima (reação negativa).
5.7.3 Comportamentos atípicos de Salmonella
Algumas cepas de Salmonella podem apresentar as seguintes reações atípicas:
fermentação da lactose (bisel do TSI e KIA ácido);
fermentação da sacarose (bisel do TSI ácido);
não produção de H2S (SIM sem H2S, TSI/KIA sem H2S);
não descarboxilação da lisina (meio ácido);
produção de indol (reação positiva no SIM).
5.8 Reação sorológica frente ao anti-soro polivalente “O”
Ressuspender o cultivo obtido em ágar estoque inclinado (de 18 a 24 horas) em aproximadamente 2 mL de solução salina 0,85%.
Em lâmina de vidro, placa de Petri ou placa de Huddleson, depositar separadamente uma gota de solução salina 2% e uma gota do soro anti-Salmonella polivalente "O", diretamente do frasco.
Em seguida, acrescentar a cada uma delas uma gota da suspensão em teste.
Com movimentos circulares, realizar a leitura com iluminação sobre fundo escuro em 1 a 2 minutos.
Classificar a reação do seguinte modo:
Positiva: presença de aglutinação somente na mistura cultivo + anti-soro;
Negativa: ausência de aglutinação em ambas as misturas;
Não específica: presença de aglutinação em ambas as misturas (formas rugosas).
As culturas que apresentarem resultados compatíveis com Salmonella, porém incapazes de assegurar sua identificação por meio da sorologia, deverão ser reisoladas em ágar não-seletivo e serem novamente submetidas à reação sorológica.
5.9 Provas opcionais: Adicionalmente, podem ser utilizados sistemas miniaturizados de provas bioquímicas para identificação de enterobactérias, aprovados para uso pela CLA/MAPA.
6. RESULTADOS
6.1 Interpretação: Emitir o resultado como positivo para Salmonella quando as culturas apresentarem reações típicas nas provas bioquímicas e reação sorológica positiva frente ao anti-soro polivalente “O”.
As culturas que apresentarem perfil bioquímico compatível com Salmonella e que não reagirem frente ao anti-soro polivalente “O” ou apresentarem reação inespecífica devem ser identificadas por método molecular ou remetidas para uma Instituição de Referência, para conclusão do resultado.
6.2 Sorotipificação: Remeter as culturas identificadas como Salmonella a uma Instituição de Referência no país, designada pela Coordenação de Laboratório Animal (CLA) para sorotipificação.
Manter no laboratório as culturas isoladas de Salmonella, adequadamente identificadas. Manter registro de todas as confirmações sorológicas realizadas pela Instituição de Referência.
6.3 Expressão dos resultados
Expressar o resultado como:
Pesquisa de Salmonella : PRESENÇA/25 g ou mL; ou
Pesquisa de Salmonella : AUSÊNCIA/25 g ou mL
7. BIBLIOGRAFIA CONSULTADA
ANDREWS, W.H.; FLOWERS, R.S.; SILLIKER, J.; BAILEY, J.S. Salmonella. In: Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods, 4. ed. Washington DC. American Public Health Association. Frances Pouch Downes & Keith Ito (Eds.), 2001. p.357-380.
ANDREWS, W.H.; HAMMACK, T.S. Salmonella. In: Bacteriological Analytical Manual Online. 2001. Disponível em: http://www.cfsan.fda.gov.
BENNETT, A.R.; MaCPHEE, S.; BETTS, R.; POST, D. 1999. Use of pyrrolidonyl peptidase to distinguish Citrobacter from Salmonella. Letters in Applied Microbiology, Oxford. 28: 175-178.
ISO. International Organization for Standardization. International Standard ISO 6579, 3.ed. 1993.
