MESÓFILOS AERÓBIOS VIÁVEIS

CONTAGEM DE MICRORGANISMOS MESÓFILOS AERÓBIOS VIÁVEIS CAPAZES DE CAUSAR ALTERAÇÃO EM PRODUTOS LÁCTEOS LÍQUIDOS UHT

BRASIL. Instrução Normativa n°. 62 de 26 de agosto de 2003. Análises microbiológicas para controle de produção de origem animal e água. Diário Oficial da União, Brasília, 18 set. 2003.

1. OBJETIVOS E ALCANCE
Estabelecer procedimento para a contagem de microrganismos mesófilos aeróbios viáveis em produtos UHT, com exclusão daqueles comprovadamente não patogênicos e não causadores de alterações físicas, químicas e organolépticas do produto.
Detectar a presença de Bacillus sporothermodurans para diferenciá-lo dos demais microrganismos mesófilos aeróbios viáveis.
Aplica-se a amostras de produtos lácteos líquidos, tratados pelo processo UHT.

2. FUNDAMENTOS
2.1 Pré-incubação: Baseia-se na incubação das amostras em estufa a 36 ± 1ºC por 7 dias e posterior verificação da ocorrência de alterações das características do produto.
2.2 Contagem em placa: Baseia-se na semeadura da amostra e suas diluições em ágar cérebro-coração e em ágar nutriente isento de extrato de levedura, seguida de incubação a 30 ± 1ºC por 72 horas, e posterior identificação dos microrganismos presentes.
2.3 Limitações do Método: Devido à opacidade produzida pela homogeneização do meio de cultura com alguns tipos de amostras, pode haver dificuldade para a contagem de colônias na diluição 100. Nesses casos, o resultado final deve ser obtido nas diluições subseqüentes, o que pode resultar em dados finais estimados.

3. REAGENTES E MATERIAIS
Vidraria e demais insumos básicos obrigatórios em laboratórios de microbiologia de alimentos;
Ágar cérebro-coração (ABHI);
Ágar nutriente isento de extrato de levedura;
Ágar esculina;
Caldo cérebro-coração nitrato (BHI-NO3);
Caldo vermelho de fenol com glicose;
Solução salina peptonada 0,1%;
Ágar uréia;
Reativo para oxidase (N'N'N'N'-tetrametil-parafenileno-diamina ou oxalato de para-amino-dimetilanilina) ou tiras para teste de oxidase (comercialmente disponíveis);
Peróxido de hidrogênio 3%;
Alfa-naftilamina 0,5%;
Ácido sulfanílico 0,8%;
Corantes para coloração de Gram;
Zinco em pó;
Etanol 70% ou Etanol 70º GL;
Reagentes para coloração de Gram.

4. EQUIPAMENTOS
Equipamentos básicos obrigatórios em laboratórios de microbiologia de alimentos.

5. PROCEDIMENTOS
5.1 Preparo da amostra: Após a pré-incubação, as amostras visualmente inalteradas devem ser agitadas por 25 vezes.
Antes da abertura, desinfetar externamente as embalagens com solução desinfetante e após com etanol 70% ou etanol 70º GL.
Deixar secar.
Com auxílio de tesouras ou bisturis previamente esterilizados, abrir a embalagem. Caso se observe alteração evidente (coagulação, floculação, dessoração, odor não característico ou outros), interromper a análise e reportar como “produto alterado após incubação a 36 ± 1ºC por 7 dias”.
As amostras que apresentarem qualquer alteração não devem ser analisadas. Reportar o resultado como “amostra alterada”, incluindo informações sobre o tipo de alteração observada.
5.2 Procedimentos de controle: Aplicar os procedimentos de controle específicos estabelecidos pelo laboratório.
5.3 Contagem em placas: Diluir a amostra em tubos contendo 9 mL de solução salina peptonada 0,1% até 10-2.
Pipetar 1mL diretamente da amostra (100) e 1 mL de cada uma das diluições preparadas (10-1 e 10-2), transferindo-as para placas de Petri estéreis, em duplicata.
Adicionar cerca de 20 mL de ágar cérebro-coração (ABHI) a uma das placas de cada diluição. Nas demais, adicionar cerca de 20mL de ágar nutriente isento de extrato de levedura.
Homogeneizar adequadamente os meios com os inóculos.
Deixar solidificar. Inverter as placas.
5.4 Incubação: Incubar as placas a 30 ± 1ºC por 72 horas.
5.5 Leitura: Verificar a presença de colônias nas placas, contando cada uma e observando suas características.
Selecionar placas que contenham entre 25 e 250 colônias para a realização da contagem.
Se os resultados de contagem obtidos em ambos os meios forem coerentes entre si, proceder conforme Anexo IV, “Procedimentos para contagem de colônias”, deste Manual.
Se os resultados forem discrepantes entre si, considerar o resultado obtido nas placas de ABHI.
Quando o crescimento bacteriano é devido à presença de esporos de Bacillus sporothermodurans na amostra em análise, será observado nas placas de ABHI um abundante crescimento de colônias lisas, de forma regular, com coloração entre branco e bege, com diâmetro máximo de 3 mm, facilmente identificáveis.
No ágar nutriente isento de extrato de levedura, o Bacillus sporothermodurans comumente não forma colônias visíveis, porém poderão se desenvolver colônias puntiformes, de coloração entre branco e bege.
Esta diferenciação é necessária porque as colônias de B.sporothermodurans não devem ser contabilizadas no cálculo de mesófilos aeróbios viáveis capazes de causar alteração no produto.
Quando for observado crescimento em ambos os meios, realizar a contagem nas placas de ABHI, registrando em separado o número de colônias suspeitas de serem Bacillus sporothermodurans, que deverão ser confirmadas de acordo com o que segue:
Repicar 3 a 5 colônias suspeitas para tubos com ABHI inclinado.
Incubar a 36 ± 1ºC por até 72h.
Realizar os testes confirmatórios.
5.6 Coloração de Gram
Preparar esfregaço e corar pelo método de Gram, conforme instruções constantes do Anexo VII, “Procedimentos de coloração”, deste Manual.
Quando forem observados bastonetes Gram positivos, realizar a prova da catalase conforme item 5.7.
Quando forem observados microrganismos com morfologia e características diferentes de bastonetes Gram positivos, reportar o número encontrado como a contagem total de microrganismos aeróbios mesófilos.
5.7 Catalase: Com auxílio de alça de platina, palito de madeira, bastão de vidro ou Pipeta de Pasteur, estéreis, transferir a cultura para uma lâmina ou placa de vidro contendo uma gota de peróxido de hidrogênio 3%. Misturar o inóculo ao peróxido e observar a reação.
A não formação de borbulhas indica prova negativa para catalase. A formação de borbulhas indica prova positiva para catalase.
A maioria dos membros do gênero Bacillus apresentam reação de catalase positiva.
Quando a coloração de Gram demonstrar a presença de bastonetes Gram positivos e a prova da catalase for positiva para a cultura em teste, confirmar a presença de Bacillus sporothermodurans por meio das provas da oxidase, crescimento em anaerobiose, hidrólise da esculina, fermentação da glicose, redução do nitrato e produção de urease, conforme abaixo descrito.
5.8 Oxidase: Usando alça de platina, Pipeta de Pasteur, palitos de madeira ou de plástico, descartáveis e estéreis, realizar a prova de oxidase, espalhando a cultura sobre papel filtro impregnado com o reativo para oxidase ou sobre tiras para teste de oxidase.
Fazer a leitura em 10 a 20 segundos. Após esse tempo, reações falso positivas podem ocorrer.
O aparecimento de cor azul (N'N'N'N'-tetrametil-parafenileno-diamina) ou vermelho intenso (oxalato de para-amino-dimetilanilina) é indicativo de uma reação positiva.
Não utilizar alças de níquel-cromo ou alças de aço inoxidável para realizar a prova de oxidase, pois traços de óxido de ferro na superfície flambada pode produzir reação falso positiva.
O Bacillus sporothermodurans apresenta reação de oxidase positiva.
5.9 Crescimento em anaerobiose: Inocular a cultura em tubos de ABHI inclinados e incubar em jarra de anaerobiose a 36 ± 1ºC por 72h.
O Bacillus sporothermodurans não cresce em anaerobiose.
5.10 Hidrólise da esculina: Inocular a cultura, com agulha, em tubos contendo ágar esculina inclinado.
Incubar a 36 ± 1ºC por 72h.
A hidrólise da esculina é evidenciada pelo enegrecimento do meio.
O Bacillus sporothermodurans hidrolisa a esculina.
5.11 Fermentação da glicose: Semear tubos com caldo vermelho de fenol-base adicionados de glicose.
Incubar a 36 ± 1ºC por até 72 horas.
A viragem de cor do indicador vermelho de fenol para amarelo indica a fermentação do açúcar presente.
O Bacillus sporothermodurans não fermenta a glicose.
5.12 Redução de nitrato: Inocular a cultura, com alça, em tubos contendo caldo BHINO3.
Incubar a 36 ± 1ºC por 72 horas.
Após incubação, adicionar aos tubos 0,5 a 1 mL de alfa naftilamina 0,5%, e 0,5 a 1 mL de ácido sulfanílico 0,8%.
O aparecimento de coloração rosa indica positividade para redução de nitrato.
Quando não houver desenvolvimento de coloração, adicionar ao tubo alguns miligramas de pó de zinco. Nessa situação, o aparecimento de coloração rosa indica reação negativa, enquanto que o não desenvolvimento de cor indica positividade.
O Bacillus sporothermodurans não reduz o nitrato a nitrito.
5.13 Prova da urease: Inocular a cultura, com alça, em tubos ou placas contendo ágar uréia.
Incubar a 36 ± 1ºC por 72h.
Observar o crescimento com mudança de coloração para rosa intenso, o que indica positividade para produção de urease.
O Bacillus sporothermodurans não produz urease.

6. RESULTADOS
A partir dos dados obtidos, calcular o número de microrganismos mesófilos aeróbios viáveis presentes na amostra em análise, seguindo as instruções contidas no Anexo IV, “Procedimentos para contagem de colônias”, deste Manual.
O número de UFC/mL de Bacillus sporothermodurans não deverá ser reportado como resultado da contagem de mesófilos aeróbios.
Quando estes microrganismos forem encontrados, fazer constar do campo “OBS” do Certificado Oficial de Análise (COA): “Presença de Bacillus sporothermodurans”.
Somente será reportado o número de unidades formadoras de colônias de outros mesófilos encontrados.
Deverão ainda acompanhar o resultado da análise informações adicionais sobre o tipo de microrganismo encontrado (como por exemplo: cocos Gram positivos, bastonetes Gram negativos, flora mista, etc.) ou o(s) microrganismo(s) aeróbio(s) presente(s), quando identificado(s).
Os resultados de contagem de microrganismos mesófilos aeróbios viáveis em leite UHT a 30ºC por até 72 horas devem ser expressos em UFC/mL.
Para todos os produtos UHT, o resultado da análise de pré-incubação por 7 dias a 36 ± 1ºC deve ser expresso como “alterado” ou “sem alteração”.

7. BIBLIOGRAFIA CONSULTADA
BRASIL. Ministério da Agricultura do Abastecimento e da Reforma Agrária. Secretaria de Defesa Agropecuária. Departamento de Defesa Animal. Manual de métodos microbiológicos para alimentos. Coordenação Geral de Laboratório Animal. 1991/1992 2ª revisão. 136p.
PETTERSSON, B.; LEMBKE, F.; HAMMER, P.; STACKEBRANDT, E.; PRIEST, F.G. Bacillus sporothermodurans, a new species producing highly-heat-resistant endospores. International Journal of Systematic Bacteriology, 1996. p. 759-764.
SWANSON, K.M.J.; PETRAN, R.L.; HANLIN, J.H. Culture methods for enumeration of microorganisms. In: Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods, 4. ed. Washington DC. American Public Health Association. Frances Pouch Downes & Keith Ito (Eds.), 2001. p. 53-62.
MORTON, R.D. Aerobic Plate Count. In: Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods, 4. ed. Washington DC. American Public Health Association. Frances Pouch Downes & Keith Ito (Eds.), 2001. p.63-67.