NÚMERO MAIS PROVÁVEL DE COLIFORMES TOTAIS E COLIFORMES TERMOTOLERANTES EM ALIMENTOS
BRASIL. Instrução Normativa n°. 62 de 26 de agosto de 2003. Análises microbiológicas para controle de produção de origem animal e água. Diário Oficial da União, Brasília, 18 set. 2003.
1. OBJETIVOS E ALCANCE
Estabelecer procedimento para a determinação do Número Mais Provável de coliformes totais e termotolerantes em alimentos.
Aplica-se a amostras de matérias-primas e alimentos, devendo ser utilizada quando o limite máximo tolerado for inferior a 100 UFC/g ou mL.
2. FUNDAMENTOS
2.1 Prova presuntiva: Baseia-se na inoculação da amostra em caldo lauril sulfato de sódio, em que a presença de coliformes é evidenciada pela formação de gás nos tubos de Durhan, produzido pela fermentação da lactose contida no meio.
O caldo lauril sulfato de sódio apresenta, em sua composição, uma mistura de fosfatos que lhe confere um poder tamponante, impedindo a sua acidificação. A seletividade do meio se deve à presença do lauril sulfato de sódio, um agente surfactante aniônico que atua na membrana citoplasmática de microrganismos Gram positivos, inibindo o seu crescimento.
2.2 Prova confirmativa para coliformes totais: A confirmação da presença de coliformes totais é feita por meio da inoculação dos tubos positivos para a fermentação de lactose em caldo verde brilhante bile lactose 2% e posterior incubação a 36 ± 1ºC. A presença de gás nos tubos de Durhan do caldo verde brilhante evidencia a fermentação da lactose presente no meio.
O caldo verde brilhante bile lactose 2% apresenta, em sua composição, bile bovina e um corante derivado do trifenilmetano (verde brilhante), responsáveis pela inibição dos microrganismos Gram positivos.
2.3 Prova confirmativa para coliformes termotolerantes: A confirmação da presença de coliformes termotolerantes é feita por meio da inoculação em caldo EC, com incubação em temperatura seletiva de 45 ± 0,2ºC a partir dos tubos positivos obtidos na prova presuntiva. A presença de gás nos tubos de Durhan evidencia a fermentação da lactose presente no meio.
O caldo EC apresenta em sua composição uma mistura de fosfatos que lhe confere um poder tamponante, impedindo a sua acidificação. A seletividade do meio se deve à presença de sais biliares, responsáveis pela inibição dos microrganismos Gram positivos.
3. REAGENTES E MATERIAIS
Vidraria e demais insumos básicos obrigatórios em laboratórios de microbiologia de alimentos;
Caldo lauril sulfato de sódio concentração simples;
Caldo lauril sulfato de sódio concentração dupla;
Caldo verde brilhante bile lactose 2%;
Caldo EC;
Solução salina peptonada 0,1%.
4. EQUIPAMENTOS
Equipamentos básicos obrigatórios em laboratórios de microbiologia de alimentos.
Banho-maria com movimentação de água (agitação ou circulação)
5. PROCEDIMENTOS
5.1 Pesagem e preparo da amostra
5.1.1 Produtos sólidos e pastosos: Pesar 25 ± 0,2 g ou pipetar 25 ± 0,2 mL da amostra de acordo com as instruções contidas no Anexo V, "Procedimentos para o preparo, pesagem e descarte de amostras", deste Manual.
Adicionar 225 mL de solução salina peptonada 0,1%.
Homogeneizar por aproximadamente 60 segundos em “stomacher”.
Esta é a diluição 10-1.
5.1.2 Produtos líquidos: Preparar as amostras de acordo com as instruções contidas no Anexo V, "Procedimentos para o preparo, pesagem e descarte de amostras", deste Manual.
5.2 Procedimentos de controle: Aplicar os procedimentos de controle específicos estabelecidos pelo laboratório.
5.3 Prova presuntiva
5.3.1 Inoculação
5.3.1.1 Produtos sólidos, pastosos e creme de leite pasteurizado: A partir da diluição inicial (10-1), inocular volumes de 10 mL em série de 3 tubos contendo caldo lauril sulfato de sódio em concentração dupla (corresponde à diluição 10º).
A seguir, inocular volumes de 1 mL da diluição inicial (10-1) em uma série de 3 tubos contendo caldo lauril sulfato de sódio em concentração simples.
A partir da diluição 10-1, preparar a diluição 10-2 em solução salina peptonada 0,1% de acordo com as instruções contidas no Anexo II, “Diluições e soluções”, deste Manual.
Inocular 1 mL da diluição 10-2 na terceira série de 3 tubos.
Havendo necessidade, outras diluições decimais podem ser inoculadas em séries de 3 tubos.
5.3.1.2 Produtos líquidos: Diretamente da amostra (100), inocular volumes de 1 mL em uma série de 3 tubos contendo caldo lauril sulfato de sódio em concentração simples.
Transferir também 1 mL da amostra para tubo contendo solução salina peptonada 0,1% de forma a obter a diluição 10-1.
A partir da diluição10-1, efetuar as demais diluições desejadas em solução salina peptonada 0,1% de acordo com as instruções contidas no Anexo II, “Diluições e soluções”, deste Manual.
A seguir, inocular volumes de 1 mL da diluição 10-1 na segunda série de 3 tubos contendo caldo lauril sulfato de sódio em concentração simples.
Inocular 1 mL da diluição 10-2 na terceira série de 3 tubos.
Havendo necessidade, outras diluições decimais poderão ser inoculadas em séries de 3 tubos.
5.3.2 Incubação: Incubar os tubos a 36 ± 1ºC por 24 a 48 horas.
5.3.3 Leitura: A suspeita de coliformes totais é indicada pela formação de gás nos tubos de Durhan (mínimo 1/10 do volume total) ou efervescência quando agitado gentilmente.
Anotar o número de tubos positivos em cada série de diluição.
Observação: A leitura pode ser feita após 24 horas de incubação, porém, só serão válidos os resultados positivos. Os tubos que apresentarem resultado negativo deverão ser reincubados por mais 24 horas.
5.4 Prova confirmativa
5.4.1 Coliformes Totais
5.4.1.1 Inoculação: Repicar cada tubo positivo de caldo lauril sulfato de sódio obtido na prova presuntiva, para tubo contendo caldo verde brilhante bile 2% lactose.
5.4.1.2 Incubação: Incubar os tubos a 36 ± 1°C por 24 a 48 horas.
5.4.1.3 Leitura: A presença de coliformes totais é confirmada pela formação de gás (mínimo 1/10 do volume total do tubo de Durhan) ou efervescência quando agitado gentilmente.
Anotar o número de tubos positivos em cada série de diluição.
Observação: A leitura pode ser feita após 24 horas de incubação, porém, só serão válidos os resultados positivos. Os tubos que apresentarem resultado negativo deverão ser reincubados por mais 24 horas.
5.4.2 Coliformes Termotolerantes
5.4.2.1 Inoculação: Repicar cada tubo positivo de caldo lauril sulfato de sódio, obtido na prova presuntiva, para tubo contendo caldo EC.
5.4.2.2 Incubação: Incubar os tubos a 45 ± 0,2°C, por 24 a 48 horas em banho-maria com agitação ou circulação de água.
5.4.2.3 Leitura: A presença de coliformes termotolerantes é confirmada pela formação de gás (mínimo 1/10 do volume total do tubo de Durhan) ou efervescência quando agitado gentilmente.
Anotar o resultado obtido para cada tubo, bem como a diluição utilizada.
Observação: A leitura pode ser feita após 24 horas de incubação, porém, só serão válidos os resultados positivos. Os tubos que apresentarem resultado negativo deverão ser reincubados por mais 24 horas.
6. RESULTADOS
A partir da combinação de números correspondentes aos tubos que apresentaram resultado positivo em cada um dos testes confirmativos (coliformes totais e coliformes termotolerantes), verificar o Número Mais Provável de acordo com o Anexo III, "Procedimentos básicos de contagem”, deste Manual.
Certificar-se que a tabela de NMP usada é a indicada para o caso específico.
Expressar o valor obtido em NMP/g ou mL.
7. BIBLIOGRAFIA CONSULTADA
HITCHINS, A.D.; FENG, P.; WATKINS W.D.; RIPPEY S.R.; CHANDLER L.A. Escherichia coli and the Coliform bacteria. In: Bacteriological Analytical Manual Online. 2001. Disponível em: http:// www.cfsan.fda.gov.
KORNACKI, J.L.; JOHNSON, J.L. Enterobacteriaceae, Coliforms and Escherichia coli as Quality and Safety Indicators. In Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods, 4. ed. Washington DC. American Public Health Association. Frances Pouch Downes & Keith Ito (Eds.), 2001. p. 69-82.
