CONTAGEM DE BOLORES E LEVEDURAS
BRASIL. Instrução Normativa n°. 62 de 26 de agosto de 2003. Análises microbiológicas para controle de produção de origem animal e água. Diário Oficial da União, Brasília, 18 set. 2003.
1. OBJETIVOS E ALCANCE
Estabelecer procedimento para a contagem de bolores e leveduras em alimentos.
Aplica-se a amostras de matérias-primas, alimentos e rações.
2. FUNDAMENTOS
Baseia-se na verificação da capacidade desses microrganismos se desenvolverem em meios de cultura com pH próximo a 3,5 e temperatura de incubação de 25 ± 1ºC.
A utilização de meios acidificados a pH 3,5 ± 0,1 promove seletivamente o crescimento de fungos, inibindo a maioria das bactérias presentes no alimento.
3. REAGENTES E MATERIAIS
Vidraria e demais insumos básicos obrigatórios em laboratórios de microbiologia de alimentos;
Ágar batata glicose 2%;
L(+) Ácido tartárico 10%;
Solução salina peptonada 0,1%.
4. EQUIPAMENTOS
Equipamentos básicos obrigatórios em laboratórios de microbiologia de alimentos.
5. PROCEDIMENTOS
5.1 Preparo das placas
Fundir o ágar batata glicose.
Resfriar em banho-maria até 46-48ºC.
Acidificar o meio até pH 3,5 por meio da adição de 1,5 mL de solução de ácido tartárico 10% para cada 100 mL de meio.
Verter nas placas cerca de 15 a 20 mL.
Deixar solidificar em superfície plana.
Identificar as placas.
Antes da utilização, secar as placas semi-abertas com o fundo voltado para cima em estufa a 50ºC por cerca de 15 minutos, ou em fluxo laminar expondo a superfície pelo tempo necessário para a completa secagem.
5.2 Pesagem e preparo da amostra
Pesar 25 ± 0,2 g ou pipetar 25 ± 0,2 mL da amostra de acordo com as instruções contidas no Anexo V, “Procedimentos para o preparo, pesagem e descarte de amostras”, deste Manual.
Adicionar 225 mL de solução salina peptonada 0,1%. Para amostras de doce de leite e de leite condensado, utilizar como diluente solução salina peptonada com 20% de glicose.
A partir da diluição inicial 10-1, efetuar as diluições desejadas, de acordo com o Anexo II, “Diluições e soluções”, deste Manual.
5.3 Procedimentos de controle
Aplicar os procedimentos de controle específicos estabelecidos pelo laboratório.
5.4 Inoculação em placas
Inocular 0,1 mL das diluições selecionadas sobre a superfície seca de ágar batata glicose 2% acidificado a pH 3,5.
Com o auxílio de alça de Drigalski ou bastão do tipo “hockey”, espalhar o inóculo cuidadosamente por toda a superfície do meio, até sua completa absorção.
Utilizar no mínimo duas diluições decimais ou duplicata da mesma diluição.
Nos casos em que a legislação exigir valores menores que 100 UFC/g ou mL, distribuir em duplicata 1 mL da diluição 10-1 em 3 placas (0,4 mL, 0,3 mL e 0,3 mL). No caso de produtos líquidos poderá ser inoculado 0,1 mL diretamente da amostra (10º), o que corresponderá à diluição 10-1.
5.5 Incubação: Incubar as placas, sem inverter, a 25 ± 1°C, por 5 a 7 dias, em incubadora de B.O.D.
5.6 Leitura: Selecionar as placas que contenham entre 15 e 150 colônias.
OBSERVAÇÃO: Não abrir, em hipótese alguma, as placas que contenham crescimento de fungos, para evitar a contaminação ambiental por meio da dispersão dos seus esporos.
6. RESULTADOS
A partir dos dados obtidos, calcular o número de microrganismos presentes de acordo com o Anexo IV, “Procedimentos para a contagem de colônias”, deste Manual.
Expressar o resultado em UFC/g ou mL.
7. BIBLIOGRAFIA CONSULTADA
TOURNAS, V.; STACK, M.E.; MISLIVEC, P.B.; KOCH, H.A.; BANDLER, R. Yeasts, molds and mycotoxins. In: Bacteriological Analytical Manual Online. 2001. Disponível em: http://www.cfsan.fda.gov
