NÚMERO MAIS PROVÁVEL DE Staphylococcus aureus
BRASIL. Instrução Normativa n°. 62 de 26 de agosto de 2003. Análises microbiológicas para controle de produção de origem animal e água. Diário Oficial da União, Brasília, 18 set. 2003.
1. OBJETIVOS E ALCANCE
Estabelecer procedimento para a determinação do NMP de Staphylococcus aureus em alimentos.
Aplica-se a amostras de alimentos em que os limites de aceitação determinados pela legislação encontram-se abaixo de 100 UFC/g ou mL.
2. FUNDAMENTOS
2.1 Determinação do NMP: Baseia-se na inoculação das diluições desejadas das amostras sob teste em caldo telurito manitol glicina, segundo Giolitti e Cantoni ou Caldo soja triptona com sal 10%- piruvato de sódio 1% (TSB-NP), com posterior confirmação em ágar Baird-Parker.
No caldo TSB-NP, a alta concentração de NaCl (10%) atua seletivamente, inibindo o crescimento de microbiota acompanhante que não apresente capacidade de se desenvolver nesta condição.
O Staphylococcus aureus reduz, anaeróbia e aerobiamente, o telurito de potássio, produzindo escurecimento do caldo Giolitti e Cantoni, bem como colônias negras no ágar Baird-Parker.
O ágar Baird-Parker, enriquecido com solução de gema de ovo, possibilita a evidenciação das atividades proteolítica e lipolítica do Staphylococcus aureus, respectivamente, por meio do aparecimento de um halo de precipitação e um de transparência ao redor da colônia.
Prova da coagulase
Baseia-se na comprovação da capacidade do microrganismo de coagular o plasma de coelho pela ação da enzima coagulase.
2.3 Provas complementares
2.3.1 Coloração de Gram: Baseia-se na verificação das características morfológicas e tintoriais do microrganismo.
2.3.2 Prova da termonuclease: Baseia-se na degradação do DNA em oligonucleotídeos pela ação da enzima DNAse produzida pelo microrganismo.
A reação é evidenciada pelo aparecimento de um halo de coloração rósea no ágar azul de toluidina e de clarificação, quando utilizado o ágar para teste de DNAse com verde de metila.
2.3.3 Prova da catalase: Baseia-se na capacidade da enzima catalase de decompor o peróxido de hidrogênio, liberando oxigênio, o que é evidenciado por meio da formação de borbulhas.
2.4 Limitações do Método: A metodologia para contagem de S. aureus, no que se refere aos resultados da prova de coagulase, apresenta limitações quanto à especificidade, devido ao fato de algumas espécies de Staphylococcus relacionadas a animais, como o S. intermedius, S. hyicus, S. delphini e S. schleiferi ssp coagulans, também serem coagulase positivas.
Cepas de S. schleiferi ssp schleiferi e algumas cepas de S. lugdunensis apresentam fraca reação na prova da coagulase. Além disto, o S. schleiferi ssp schleiferi apresenta reação de termonuclease positiva.
3. REAGENTES E MATERIAIS
Vidraria e demais insumos básicos obrigatórios em laboratórios de microbiologia de alimentos;
Ágar Baird-Parker-base;
Ágar azul de toluidina - DNA ou Ágar para ensaio de DNAse com verde de metila;
Ágar estoque;
Caldo soja triptona sal 10%-piruvato de sódio 1% (TSB-NP) ou Caldo telurito manitol glicina segundo; Giolitti e Cantoni (GC);
Caldo cérebro-coração (BHI);
Solução salina peptonada 0,1%;
Solução salina 0,85%;
Solução de azul de toluidina 1%;
Emulsão de gema de ovo a 50%;
Telurito de potássio 3,5%;
Plasma de coelho oxalatado ou com EDTA;
Peróxido de hidrogênio 3%;
Etanol 70% ou Etanol 70º GL;
Reagentes para coloração de Grãm.
4. EQUIPAMENTOS
Equipamentos básicos obrigatórios em laboratórios de microbiologia de alimentos.
5. PROCEDIMENTOS
5.1 Pesagem e preparo da amostra
5.1.1 Alimentos sólidos: Pesar 25 ± 0,2 g da amostra de acordo com as instruções contidas no Anexo V, “Procedimentos para o preparo, pesagem e descarte de amostras”, deste Manual.
Adicionar 225 mL de solução salina peptonada 0,1%.
Homogeneizar por aproximadamente 60 segundos no “stomacher”.
Esta é a diluição10-1.
A partir da diluição inicial 10-1, efetuar as diluições desejadas de acordo com o Anexo II, “Diluições e soluções”, deste Manual.
Inocular 1 mL de cada diluição selecionada em três séries de três tubos contendo caldo telurito manitol glicina (GC) ou caldo TSBNP.
Adicionar a cada tubo de caldo GC uma camada de 1 a 2 mL de selo estéril (vaspar, vaselina, óleo mineral ou parafina líquida, estéreis e previamente fundidos).
5.1.2 Alimentos líquidos: Pipetar 1 mL diretamente da amostra e tranferir para cada um dos três tubos contendo caldo GC ou caldo TSB-NP.
Transferir também 1 mL da amostra para um tubo contendo 9 mL de solução salina peptonada 0,1% (diluição 10-1).
A partir da diluição inicial 10-1, efetuar as diluições desejadas de acordo com o Anexo II, “Diluições e soluções”, deste Manual.
Inocular 1 mL das duas diluições subseqüentes em séries de três tubos com caldo GC ou caldo TSB-NP.
Adicionar uma camada de 1 a 2 mL de selo estéril (vaspar, vaselina, óleo mineral ou parafina líquida, estéreis e previamente fundidos) a cada tubo de caldo GC.
5.2 Procedimentos de controle: Aplicar os procedimentos de controle específicos estabelecidos pelo laboratório.
5.3 Incubação: Incubar a 36 ± 1ºC por 48 horas.
5.4. Leitura: Fazer a leitura anotando os tubos que apresentarem escurecimento: do meio ou precipitado negro em caldo GC e turvação em: caldo TSB-NP.
5.5. Provas confirmatórias: Com pipetas de Pasteur estéreis, retirar do fundo de cada tubo de caldo GC positivo uma gota da cultura e colocá-la sobre a superfície seca de ágar Baird-Parker, junto à borda da placa, estriando posteriormente com alça, de forma a obter colônias isoladas.
A partir dos tubos de caldo TSB-NP que apresentarem turvação, com auxílio de alça de platina ou níquel-cromo, repicar sobre a superfície seca de ágar Baird-Parker.
Incubar a 36 ± 1ºC por 30 a 48 horas.
Selecionar de 2 a 3 colônias negras, brilhantes, com anel opaco de precipitação e/ou rodeadas por halo transparente, correspondentes a cada um dos tubos positivos e repicar cada colônia para um tubo contendo caldo BHI.
Incubar a 36 ± 1ºC por 18 a 24 horas. A partir das culturas em BHI, efetuar a prova da coagulase.
5.5.1 Prova da coagulase: Transferir 0,3 mL de cada tubo de cultivo em BHI para tubos estéreis contendo 0,3 mL de plasma de coelho.
Incubar a 36 ± 1ºC, por 6 horas.
Verificar a presença de coágulos, considerando os critérios a seguir:
Reação negativa: não formação de coágulo;
Reação 1+ : coágulo pequeno e desorganizado;
Reação 2+ : coágulo pequeno e organizado;
Reação 3+ : coágulo grande e organizado;
Reação 4+: coagulação de todo o conteúdo do tubo que não se desprenderá quando o tubo for invertido;
Quando a reação de coagulação for do tipo 3+ e 4+, considerar a prova positiva para Staphylococcus aureus; Quando a reação de coagulação for negativa, considerar a prova negativa para Staphylococcus aureus;
Quando a reação for duvidosa do tipo 1+ e 2+, repicar do mesmo caldo de cultura para um tubo contendo ágar estoque ou caldo BHI. Incubar a 36 ± 1ºC por 24 horas para a realização dos testes complementares.
5.6 Testes complementares: A partir da cultura pura em caldo BHI ou ágar estoque, realizar as seguintes provas confirmativas:
5.6.1 Coloração de Gram: Preparar esfregaço e corar pelo método de Gram.
A ausência de cocos Gram positivos indica teste negativo para Staphylococcus aureus. A presença de cocos Gram positivos indica a necessidade da realização de testes complementares.
5.6.2 Pesquisa da termonuclease: Fazer orifícios eqüidistantes, com cerca de 2 mm de diâmetro, no ágar para ensaio da termonuclease ou no ágar azul de toluidina - DNA, em placas previamente preparadas.
Colocar os tubos das culturas mantidas em caldo BHI em banho-maria fervente por 15 minutos. Deixar esfriar e preencher completamente um orifício para cada cultivo a ser analisado. Incubar a 36 ± 1ºC por 4 horas ou a 50 ± 2ºC por 2 horas.
O aparecimento de um halo rosa no ágar azul de toluidina ou de um halo de clarificação no ágar para ensaio de DNAse com verde de metila, será indicativo de reação positiva para termonuclease.
Considerar como positivas as culturas que apresentarem halo de diâmetro superior a 1 mm. O Staphylococcus aureus é termonuclease positiva.
5.6.3 Prova da catalase
Com auxílio de alça de platina, bastão de vidro, palito de madeira ou pipeta de Pasteur, estéreis, retirar uma alíquota do cultivo em ágar estoque e transferir para uma lâmina ou placa de vidro contendo uma gota de peróxido de hidrogênio a 3%.
Misturar o inóculo ao peróxido e observar a reação.
A não formação de borbulhas indica prova negativa para catalase.
A formação de borbulhas indica prova positiva para catalase.
O Staphylococcus aureus é catalase positiva.
6. RESULTADOS
A partir da combinação de números correspondentes aos tubos que apresentaram resultado positivo em cada um dos testes confirmativos, verificar o Número Mais Provável de acordo com o Anexo III, “Procedimentos básicos de contagem”, deste Manual.
Certificar-se de que a tabela de NMP em uso é a indicada para cada caso específico.
Expressar o valor obtido em NMP/g ou mL.
7. BIBLIOGRAFIA CONSULTADA
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