CONTAGEM DE Bacillus cereus
BRASIL. Instrução Normativa n°. 62 de 26 de agosto de 2003. Análises microbiológicas para controle de produção de origem animal e água. Diário Oficial da União, Brasília, 18 set. 2003.
1. OBJETIVOS E ALCANCE
Estabelecer procedimento para a contagem de Bacillus cereus.
Aplica-se a matérias primas e alimentos.
2. FUNDAMENTOS
2.1 Contagem: Baseia-se na inoculação das diluições desejadas das amostras sob teste em ágar polimixina gema de ovo vermelho de fenol (MYP) ou em ágar cereus (PEMBA).
Em ambos é adicionada emulsão de gema de ovo que objetiva a verificação da produção de lecitinase pelo B.cereus .
No ágar PEMBA, a presença de 0,1% de peptona associada ao piruvato de sódio evidencia a precipitação da lecitina da gema do ovo adicionada ao meio.
A polimixina B é um agente seletivo utilizado nos dois meios, que atua sobre a flora acompanhante. No PEMBA, quando um grande número de leveduras é esperado no alimento, poderá ser adicionada também cicloheximide (40µg/mL) como agente seletivo.
Estes dois meios contêm manitol, carbohidrato não fermentado pelo B.cereus . No MYP, o indicador de pH é o vermelho de fenol e no PEMBA, o azul de bromotimol.
2.2 Provas Bioquímicas: A identificação bioquímica de Bacillus cereus baseia-se na verificação de produção de â-hemolisina, motilidade em meio semisólido, na capacidade de decomposição da tirosina, redução do nitrato a nitrito, verificação do tipo de crescimento em superfície de ágar nutriente, e da não produção de corpúsculos de inclusão cristalina.
3. REAGENTES E MATERIAIS
Vidraria e demais insumos básicos obrigatórios em laboratórios de microbiologia de alimentos; Solução salina peptonada 0,1%;
Ágar nutriente;
Ágar manitol gema de ovo polimixina segundo Mossel (MYP) ou Ágar cereus (PEMBA);
Ágar estoque;
Ágar Columbia sangue de carneiro desfibrinado;
Ágar tirosina;
Ágar motilidade - nitrato;
Ácido sulfanílico solução 0,8%;
Alfa-naftilamina solução aquosa 0,5%;
Polimixina B - solução contendo 5.000 UI/mL;
Emulsão de gema de ovo 50%;
Sangue de carneiro desfibrinado;
Ácido acético 5N;
Zinco em Pó;
Reagentes para coloração de corpúsculos de inclusão cristalina;
Reagentes para coloração de Gram.
4. EQUIPAMENTOS
Equipamentos básicos obrigatórios em laboratórios de microbiologia de alimentos.
5. PROCEDIMENTOS
5.1 Pesagem e preparo da amostra: Pesar 25 ± 0,2 g ou pipetar 25 ± 0,2 mL da amostra de acordo com as instruções contidas no Anexo V, “Procedimentos para o preparo, pesagem e descarte de amostras”, deste Manual.
Adicionar 225 mL da solução salina peptonada 0,1%.
Homogeneizar por aproximadamente 60 segundos em “stomacher”.
Esta é a diluição 10-1.
5.2 Procedimentos de controle: Aplicar os procedimentos de controle específicos estabelecidos pelo laboratório.
5.3 Inoculação
A partir da diluição inicial 10-1, efetuar as diluições desejadas conforme o Anexo II, “Diluições e soluções”, deste Manual.
Inocular sobre a superfície seca do ágar MYP ou ágar PEMBA 0,1 mL de cada diluição selecionada.
Com auxilio de alça de Drigalski ou bastão tipo “hockey”, espalhar o inóculo cuidadosamente por toda a superfície do meio até completa absorção.
Utilizar, no mínimo, duas diluições decimais ou duplicata da mesma diluição.
Nos casos em que for necessária a obtenção de resultado menor que 100 UFC/g ou mL distribuir 1 mL da diluição 10-1 em 3 placas (0,4 mL, 0,3 mL e 0,3 mL).
No caso de amostras líquidas, poderá ser inoculado 0,1 mL diretamente da amostra.
5.4 Incubação: Incubar as placas invertidas a 30 ± 1ºC por 30 a 48 horas.
5.5 Leitura: Selecionar as placas que contenham entre 15 e 150 colônias.
Contar as colônias rodeadas por um halo de precipitação opaco sobre um fundo róseo, no ágar MYP e azul turquesa com aspecto recortado, com cerca de 5 mm de diâmetro e rodeadas por halo de precipitação de lecitina hidrolizada, no ágar PEMBA.
Selecionar 3 a 5 colônias típicas e semeá-las em tubos com ágar estoque inclinado.
Incubar a 36 ± 1ºC por 24 horas.
De cada tubo, fazer esfregaço e corar pelo método Gram para verificar a presença de bastonetes curtos Gram positivos, com extremidades quadradas dispostos em cadeias.
Os esporos são centrais ou sub-terminais.
Das culturas puras em ágar estoque inclinado, realizar as seguintes provas:
5.6 Identificação Bioquímica
5.6.1 Motilidade e redução de nitrato
Inocular, com agulha, tubos contendo ágar motilidade-nitrato.
Incubar a 36 ± 1ºC por 18 a 24 horas.
Após incubação, verificar o tipo de crescimento presente.
Culturas imóveis mostram crescimento apenas na linha de inoculação, enquanto que as móveis crescem de forma difusa.
O Bacillus cereus em 50 a 90% dos casos mostra-se móvel.
Após a leitura da motilidade, adicionar aos tubos 2 a 3 gotas de alfa naftilamina 0,5% e 2 a 3 gotas de ácido sulfanílico 0,8%. O aparecimento de coloração rosa indica positividade para redução de nitrato.
Quando não houver desenvolvimento de coloração, adicionar ao tubo alguns miligramas de pó de zinco. Nesta situação, o aparecimento de coloração rosa indica reação negativa, enquanto que o não desenvolvimento de cor indica positividade.
O Bacillus cereus reduz o nitrato a nitrito.
5.6.2 â-hemólise em ágar sangue de carneiro.
Inocular por estria em placa com ágar sangue de carneiro.
Incubar a 36 ± 1ºC por 24 horas. Observar a produção de â-hemólise característica do Bacillus cereus.
Bacillus cereus é produtor de â-hemólise.
5.6.3 Decomposição da tirosina: Inocular por estrias a superfície de ágar tirosina (inclinado em tubo ou distribuído em placas).
Incubar a 36 ± 1ºC por 48 horas. Após incubação, observar o aparecimento de uma zona clara próxima ao crescimento produzida pela decomposição da tirosina.
Nos casos em que houver dúvidas, reincubar por até 7 dias a 36 ± 1ºC.
O Bacillus cereus decompõe a tirosina.
5.6.4 Crescimento rizóide: Inocular com alça sobre a superfície seca de ágar nutriente, depositando o inóculo no ponto central da placa.
Incubar a 36 ± 1ºC por 48 a 72 horas.
Após incubação verificar o tipo de crescimento.
Crescimento rizóide se caracteriza pelo aparecimento de colônias com longas extensões em forma de raízes ou longos fios, típicas de Bacillus mycoides.
O Bacillus cereus não apresenta crescimento rizóide, porém algumas cepas podem apresentar colônias rugosas em forma de galáxia.
5.6.5 Teste para verificação da presença de corpúsculos de inclusão cristalina.
A partir das culturas suspeitas repicadas em ágar estoque inclinado (item 5.5) e deixadas em temperatura ambiente por 2 a 3 dias, verificar a presença de corpúsculos de inclusão cristalina procedendo conforme item 7 do Anexo VII, “Procedimentos de coloração”, deste Manual.
A presença de cristais tetragonais de toxina são abundantes em culturas velhas (3-4 dias) de Bacillus thuringiensis, que são liberados somente após a lise do esporângio. Verifica-se então a presença dos cristais e esporos livres.
O Bacillus cereus não produz corpúsculos de inclusão cristalina.
PROVAS DIFERENCIAIS PARA MICRORGANISMOS DO GÊNERO Bacillus
Bacillus megaterium Bacillus cereus Bacillus thuringiensis Bacillus mycoides Bacillus anthracis
Coloração de Gram + +a + + +
Catalase + + + + +
Motilidade ± ±b ± -c -
Redução de nitrato -d + ± + +
Hemólise em sangue de carneiro - + + + -d
Decomp. da tirosina ± + + ± -d
Corpúsc.de inclusão cristalina - - + - -
Crescimento rizóide - - - + -
a: 90 a 100% são positivos
b: 50 a 90% são positivos
c: 90 a 100% são negativos
d: a maioria é negativa
6.RESULTADOS
A partir dos dados obtidos, calcular o número de microrganismos presentes na amostra em análise seguindo as instruções contidas no Anexo IV, “Procedimentos para contagem de colônias”, deste Manual.
Calcular o número de Bacillus cereus multiplicando o número de colônias confirmadas, nas provas confirmativas, pelo fator de diluição usado, conforme recomendações constantes no Anexo III, “Procedimentos básicos de contagem”, deste Manual.
Expressar o resultado em UFC/g ou mL.
7. BIBLIOGRAFIA CONSULTADA
BRASIL. Ministério da Agricultura e do Abastecimento. Regulamentos técnicos de identidade e qualidade de leite e produtos lácteos. Ministério da Agricultura e do Abastecimento/ Secretaria de Defesa Animal/ Departamento de Inspeção de Produtos de Origem Animal/ Divisão de Normas Técnicas. Brasília, D.F. Série Regulamentação Técnica de Identidade e Qualidade de Produtos de Origem Animal; n.2. 1997, 77p.
BENNETT, R.W.and BEHY, N. . Bacillus cereus . In: Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods. Frances Pouch Downes & Keith Ito (Eds.). 4.ed. Washington DC: American Public Health Association, 2001, p.311-316
MAC FADDIN, J.F. Pruebas bioquímicas para la identificación de bacterias de importancia clínica. Buenos Aires: Editorial Médica Panamericana S.A. 1980, 275p.
RHODEHAMEL, E.J. and HARMON, S.M. Bacillus cereus. In: Bacteriological Analytical Manual Online. 2001. Disponível em: http://www.cfsan.fda.gov.
