SEMEADURAS

TÉCNICAS DE SEMEADURA E ISOLAMENTO DE CULTURAS PURA

1.Introdução: O Desafio da Cultura Mista

Na natureza, os microrganismos não habitam ecossistemas isolados; ao contrário, eles coexistem em complexas culturas mistas, onde múltiplas espécies diferentes ocupam e compartilham o mesmo ambiente biológico. Diante de uma amostra clínica — seja saliva, secreção nasal, otológica, orofaríngea ou exsudato de feridas —, o microbiologista depara-se com um ecossistema polimicrobiano, composto tanto por patógenos quanto por membros da microbiota comensal nativa.

Para que seja possível determinar com precisão as características bioquímicas, fisiológicas e de sensibilidade a antimicrobianos de um agente infeccioso, é imperativo que ele seja isolado em uma cultura pura (ou estirpe pura). Uma cultura é considerada pura quando todas as células da população são geneticamente idênticas, tendo se originado a partir de uma única célula parental comum (clone). O ato técnico de introduzir esse material biológico em um meio de cultura nutriente é denominado semeadura, e a escolha da técnica ideal depende intrinsecamente de três fatores fundamentais:

  1. A origem e a natureza do material a ser analisado;
  2. A espécie microbiana que se suspeita estar presente na amostra;
  3. As necessidades nutricionais específicas dos organismos em ecossistema

2.Princípios de Biossegurança e Boas Práticas na Semeadura

A manipulação de culturas bacterianas vivas exige a aplicação rigorosa de técnicas assépticas para prevenir a contaminação do ambiente, do analista e das próprias amostras. Antes de iniciar qualquer protocolo de semeadura, devem ser seguidas as seguintes diretrizes de biossegurança:

  • Desinfecção da Área: Limpar e desinfetar meticulosamente a bancada ou mesa de trabalho com álcool a 70% antes e após as atividades.
  • Zona de Assepsia: Executar todos os passos técnicos estritamente dentro do raio de segurança térmica e asséptica gerado pelo calor do bico de Bunsen.
  • Flambagem de Instrumentos: Esterilizar a alça de platina (ou agulha de semeadura) aquecendo-a ao rubro na chama do bico de Bunsen antes e imediatamente após tocar em qualquer material biológico.
  • Organização Vertical: Dispor tubos de ensaio, alças e agulhas sempre na posição vertical em suportes e estantes apropriadas, minimizando riscos de acidentes, derramamentos ou trocas.
  • Descarte Seguro: Depositar pipetas e swabs usados imediatamente em recipientes robustos contendo soluções detergentes ou desinfetantes adequadas.
  • Rastreabilidade: Identificar de forma clara e indelével todo o material de trabalho (placas e tubos) com os dados da amostra e data de processamento.
  1. Principais Técnicas de Semeadura em Meios Sólidos

Os meios sólidos acondicionados em placas de Petri (como o ágar Mueller-Hinton ou ágar sangue) são os suportes de eleição para o isolamento de colônias bacterianas individualizadas.

 

3.1 Semeadura por Esgotamento (Estrias)

É a técnica mais universalmente empregada para a obtenção de colônias isoladas a partir de uma alta carga bacteriana primária.

  • Técnica: Com a alça de platina esterilizada e resfriada, colhe-se uma alíquota do material biológico e faz-se a inoculação em um setor inicial da placa (setor 1), realizando estrias paralelas e muito próximas. Flamba-se a alça, rotaciona-se a placa e, a partir das últimas estrias do primeiro setor, realizam-se novas estrias para o setor 2. O processo é repetido sucessivamente para os setores subsequentes.
  • Princípio Biofísico: À medida que a alça desliza pelos diferentes quadrantes da placa, ocorre o esgotamento mecânico da carga bacteriana na superfície do ágar. Como resultado, nos setores finais, as células bacterianas são depositadas individualmente de forma tão distanciada que, após a incubação na estufa a 37oC, cada célula isolada multiplica-se até originar uma colônia visível e macroscopicamente pura.

3.2 Semeadura por Espalhamento em Superfície (Técnica de Drigalsky)

Técnica comumente voltada para a enumeração (contagem) de colônias ou para testes onde se busca um crescimento confluente uniforme em toda a superfície do meio de cultura.

Técnica: Deposita-se um volume calibrado da amostra (ou de suas diluições em tubos contendo salina estéril) no centro da placa de ágar com o auxílio de uma pipeta de 1 mL. Em seguida, utiliza-se a alça de Drigalsky (uma haste de vidro ou metal em formato de triângulo ou "L"), previamente esterilizada por imersão em um béquer com álcool e flambada, para espalhar uniformemente o líquido por toda a extensão da placa através de movimentos rotatórios.

3.3 Semeadura com Swab Estéril (Tapete Confluente)

Técnica mandatória para a execução do Teste de Sensibilidade aos Antimicrobianos (Antibiograma/Método de Difusão em Disco).

  • Técnica: Mergulha-se um swab estéril na suspensão bacteriana padronizada. Retira-se o excesso de líquido pressionando suavemente a haste contra a parede interna do tubo. Fricciona-se o swab sobre toda a superfície do ágar Mueller-Hinton em três direções diferentes (ângulos de 60o), garantindo que nenhuma área fique sem inóculo. O objetivo desta técnica é obter um "tapete" bacteriano perfeitamente homogêneo e denso após a incubação na estufa.

4.Técnicas de Semeadura em Meios de Triagem Bioquímica

Para a caracterização fisiológica e metabólica de bactérias já isoladas, utilizam-se meios de cultura específicos acondicionados em tubos de ensaio.

4.1 Semeadura por Picada Estrita (Meios Semissólidos)

  • Aplicação: Utilizada principalmente em meios semissólidos destinados à avaliação da motilidade bacteriana.
  • Técnica: Emprega-se uma agulha de semeadura (fio reto de platina). Após flambar e colher a colônia pura, introduz-se a agulha verticalmente em uma linha reta exata até o fundo do tubo, retirando-a pelo mesmo trajeto. Bactérias móveis migrarão para além da linha da picada, turvando o meio, enquanto as imóveis, crescerão restritas ao trajeto da agulha.

4.2 Semeadura por Picada e Estria (Tubos Inclinados/Rampa)

  • Aplicação: Técnica padrão para meios diferenciais complexos, como o Kligler (Tríplice Açúcar Ferro) ou o Citrato de Simmons, que avaliam rotas metabólicas distintas na base anaeróbia e na rampa aeróbia do tubo.
  • Técnica: Utilizando a agulha de semeadura, realiza-se primeiro uma picada firme até o fundo do tubo (para avaliar o metabolismo em anaerobiose) e, ao retirar a haste, realiza-se um movimento em zigue-zague sobre a rampa inclinada superior do ágar (estria na rampa, para avaliar o metabolismo aeróbio).

 

5.Conservação e Manutenção de Culturas Puras

Uma vez que o patógeno tenha sido isolado com sucesso através das técnicas de semeadura, torna-se necessário manter as culturas celulares viáveis e biologicamente estáveis para estudos complementares, fins didáticos ou investigações epidemiológicas. O armazenamento divide-se de acordo com o horizonte temporal pretendido:

5.1 Armazenamento por Curto Período

As culturas bacterianas puras podem ser mantidas sob a temperatura de refrigeradores domésticos ou laboratoriais comerciais, calibrados entre 4oC e 10oC. O frio reduz drasticamente a taxa metabólica e a velocidade de divisão celular sem matar os microrganismos. Para a manutenção dessas coleções vivas de curto prazo, adota-se rotineiramente a transferência periódica, que consiste na semeadura sistemática e cíclica das bactérias para tubos com meios de cultura novos (repiques), ou a conservação das colônias sob uma camada de óleo mineral estéril, que atua reduzindo a evaporação da água e o contato direto com o oxigênio atmosférico.

5.2 Armazenamento por Longo Período e Bancos de Germoplasma

Para preservar a identidade e a estabilidade genética original das células por anos ou décadas, impedindo variações mutacionais ou a perda por dessecação, utilizam-se técnicas avançadas de criopreservação ou desidratação:

  • Congelamento Profundo: As células são mantidas imersas em freezers científicos de ultra-baixa temperatura (variando de -70oC a -120oC) ou criopreservadas em cubas de nitrogênio líquido a -196oC. Geralmente adicionam-se agentes crioprotetores (como o glicerol) para impedir a formação de cristais de gelo que romperiam a membrana celular.
  • Liofilização: Consiste em um processo altamente sofisticado onde as células bacterianas são inicialmente congeladas de forma rápida e, em seguida, submetidas à desidratação por sublimação da água sob condições de alto vácuo. O produto final apresenta-se como uma pastilha seca, selada hermeticamente em ampolas de vidro a vácuo, capaz de resistir intacta à temperatura ambiente por longos períodos.

Essas metodologias de ponta estruturam as chamadas Coleções de Culturas padronizadas, autênticos "bancos de microrganismos" que mantêm cepas de referência mundial à disposição de pesquisadores, professores e investigadores de patentes em todo o globo terráqueo

 

6.POP - Semeadura de Urina para Urocultura

6.1. Objetivo: Padronizar a técnica de contagem de microrganismos em amostras de urina utilizando diluição seriada, visando determinar a carga bacteriana (UFC/mL) e isolar o patógeno para identificação e teste de sensibilidade.

6.2. Meio de Cultura Adequado. Para a urocultura, utilizam-se preferencialmente meios sólidos que permitam a diferenciação e o isolamento, sendo o Ágar CLED (Cistina Lactose Eletrólito Deficiente) ou o Ágar Sangue os mais indicados, frequentemente utilizados em conjunto com meios seletivos (ex: Ágar MacConkey) para distinguir bactérias fermentadoras de lactose.

6.3. Materiais e Equipamentos

  • Amostra de urina homogeneizada.
  • Tubos de ensaio contendo salina estéril (para diluições).
  • Pipetas estéreis (1 mL).
  • Alça de Drigalsky (ou alça de platina).
  • Placas de Petri com meio de cultura (ex: Ágar CLED/Sangue).
  • Bico de Bunsen (para manutenção da zona de assepsia).

6.4. Procedimento Técnico

6.4.1 Preparo das Diluições Seriadas

A diluição seriada é fundamental quando se suspeita de alta carga bacteriana para permitir a contagem individual de colônias.

  1. Prepare uma série de tubos com 9 mL de salina estéril.
  2. Transfira 1 mL da amostra de urina original para o primeiro tubo (diluição 10-1).
  3. Homogeneíze e transfira 1 mL desta diluição para o segundo tubo (diluição 10-2), repetindo o processo conforme a necessidade de quantificação.

6.4.2 Semeadura por Espalhamento (Técnica de Drigalsky)

  1. Deposite um volume calibrado (ex: 0,1 mL ou 1 mL) da amostra ou de suas diluições no centro da placa de ágar.
  2. Esterilize a alça de Drigalsky por imersão em álcool e flambagem.
  3. Espalhe uniformemente o inóculo por toda a superfície do meio de cultura através de movimentos rotatórios.

6.5. Incubação e Cálculo de UFC/mL

  1. Inverta as placas e incube em estufa a 37°C.
  2. Após o período de incubação, selecione a placa que apresente entre 30 e 300 colônias para contagem.
  3. Calcule a concentração bacteriana utilizando a fórmula:

 

UFC/ml =

Número de Colônias

Volume Inoculado (mL) X Fator de Diluição

 

6.6. Boas Práticas e Biossegurança

  • Zona de Assepsia: Execute todos os passos dentro do raio de segurança térmica do bico de Bunsen.
  • Desinfecção: Limpe a área de trabalho com álcool 70% antes e depois da atividade.
  • Descarte: Elimine pipetas e materiais utilizados em recipientes com desinfetante.
  • Identificação: Identifique todas as placas e tubos com os dados da amostra e data.

 

7.POP: Semeadura de Amostras de Fezes (Coprocultura)

7.1. Objetivo: Padronizar a técnica de semeadura de amostras fecais para o isolamento de microrganismos patogênicos entéricos, permitindo a separação entre patógenos e a microbiota comensal.

7.2. Meios de Cultura Adequados: Para a coprocultura, é necessário o uso de meios de cultura que permitam o isolamento e a diferenciação de patógenos entéricos, geralmente associando:

  • Meios Seletivos e Diferenciais: Meios como o Ágar MacConkey são indicados para distinguir bactérias fermentadoras de lactose de não fermentadoras.
  • Nota: A escolha do meio deve considerar as necessidades nutricionais específicas dos organismos suspeitos e a natureza da amostra polimicrobiana.

7.3. Materiais e Equipamentos

  • Amostra de fezes (ou swab retal, dependendo da solicitação clínica).
  • Alça de platina (ou agulha de semeadura).
  • Bico de Bunsen.
  • Placas de Petri contendo os meios de cultura seletivos/diferenciais.
  • Álcool 70% para desinfecção.
  • Recipiente para descarte de material biológico com solução desinfetante.

7.4. Procedimento Técnico O método de escolha para amostras fecais, visando o isolamento de colônias individualizadas a partir de uma alta carga bacteriana, é a Semeadura por Esgotamento (Estrias):

  1. Preparação: Limpar a bancada com álcool 70% e acender o bico de Bunsen para estabelecer a zona de assepsia.
  2. Identificação: Identificar claramente as placas com os dados da amostra e a data.
  3. Inoculação (Setor 1): Flambar a alça de platina até o rubro e aguardar o resfriamento. Colher uma alíquota do material fecal e realizar estrias paralelas e próximas em um setor inicial da placa.
  4. Esgotamento (Setores subsequentes): Flambar a alça novamente. Rotacionar a placa e, a partir das últimas estrias do setor anterior, realizar novas estrias para o setor 2. Repetir o processo (flambar, rotacionar, estriar) para os setores seguintes.
  5. Finalização: Ao final do esgotamento mecânico nos últimos setores, as células serão depositadas de forma isolada, permitindo o crescimento de colônias puras após a incubação.

7.5. Incubação

  • Inverter as placas e incubar em estufa a 37°C.

7.6. Boas Práticas e Biossegurança

  • Zona de Assepsia: Todos os passos devem ser executados estritamente dentro do raio de ação térmica do bico de Bunsen.
  • Segurança: A alça deve ser sempre flambada antes e imediatamente após o contato com a amostra.
  • Descarte: Materiais utilizados devem ser descartados imediatamente em recipientes com desinfetante após o uso.
  • Organização: Manter tubos e alças na posição vertical durante o processamento para evitar acidentes.

 

8.POP: Semeadura de Amostras de Secreções

8.1. Objetivo: Padronizar a técnica de semeadura de amostras biológicas (saliva, secreção nasal, otológica, orofaríngea ou exsudato de feridas) visando o isolamento de microrganismos em culturas puras para posterior análise clínica.

8.2. Meios de Cultura Adequados

  • Meios Sólidos: Utilizam-se suportes como o Ágar Sangue ou Ágar Mueller-Hinton, que são ideais para o isolamento de colônias bacterianas individualizadas a partir de amostras clínicas.
  • Critério de escolha: A seleção do meio deve considerar a origem do material, a espécie microbiana suspeita e as necessidades nutricionais dos microrganismos presentes no ecossistema da amostra.

8.3. Materiais e Equipamentos

  • Amostra de secreção (colhida via swab ou outro método clínico).
  • Alça de platina ou agulha de semeadura.
  • Placas de Petri com os meios de cultura selecionados.
  • Bico de Bunsen (para criar a zona de assepsia).
  • Recipientes para descarte com soluções desinfetantes.
  • Álcool 70% para desinfecção da bancada.

8.4. Procedimento Técnico (Semeadura por Esgotamento)

A técnica recomendada é a Semeadura por Esgotamento (Estrias), ideal para obter colônias isoladas a partir de amostras com alta carga bacteriana.

  1. Preparação: Limpar a bancada com álcool 70% e trabalhar estritamente dentro da zona de assepsia gerada pelo calor do bico de Bunsen.
  2. Identificação: Etiquetar as placas com os dados da amostra e a data.
  3. Inoculação Inicial: Flambar a alça de platina até o rubro e resfriá-la. Colher uma alíquota do material biológico e realizar estrias paralelas e muito próximas em um setor da placa (setor 1).
  4. Esgotamento: Flambar a alça novamente, rotacionar a placa e, partindo das estrias do setor anterior, realizar novas estrias para o setor 2. Repetir este processo para os setores subsequentes, garantindo o esgotamento mecânico da carga bacteriana na superfície do ágar.
  5. Resultado: Após a incubação a 37°C, as células depositadas individualmente nos setores finais originarão colônias puras.

8.5. Boas Práticas e Biossegurança

  • Manipulação: Manter tubos e alças sempre em posição vertical para evitar acidentes ou trocas.
  • Esterilização: Flambar a alça antes e imediatamente após tocar em qualquer material biológico.
  • Descarte: Depositar swabs e materiais descartáveis imediatamente em recipientes com soluções desinfetantes após o uso.

 

9.POP: Semeadura de Ponta de Cateter Intravascular

9.1. Objetivo: Realizar a cultura semiquantitativa da ponta de cateter para diferenciar a colonização bacteriana da infecção relacionada ao dispositivo, conforme a técnica recomendada por Maki et al.

9.2. Meios de Cultura Adequados

  • Ágar Sangue: É o meio de cultura de eleição para esta técnica, permitindo a visualização e contagem de colônias isoladas.

9.3. Materiais e Equipamentos

  • Amostra: 5 cm da porção mais distal do cateter, enviada em frasco estéril e seco (sem meio de cultura).
  • Pinça cirúrgica ou anatômica estéril.
  • Bico de Bunsen.
  • Placas de Petri com Ágar Sangue.
  • Álcool 70% para desinfecção da bancada.

 

9.4. Procedimento Técnico (Técnica de Maki/Rolamento)

  1. Preparo: Realizar a assepsia da bancada com álcool 70% e acender o bico de Bunsen para assegurar a zona de trabalho asséptica.
  2. Identificação: Etiquetar a placa com os dados do paciente, número de registro, data e tipo de amostra.
  3. Inoculação:
    • Com auxílio de uma pinça previamente flambada e resfriada, retirar o segmento de 5 cm da ponta do cateter.
    • Fazer o rolamento da superfície externa do cateter sobre o Ágar Sangue, exercendo uma leve pressão para garantir o contato de toda a superfície com o meio.
    • O rolamento deve ser realizado de 4 a 5 vezes, percorrendo a superfície da placa.
  4. Incubação:
    • Inverter as placas e incubar em estufa a 35°C–37°C.
    • A leitura deve ser realizada após 24 a 48 horas de incubação.

9.5. Biossegurança e Critérios de Rejeição

  • Rejeição: Não processar cateteres de Foley ou amostras enviadas em meios de cultura ou formalina.
  • Descarte: Todo material biológico deve ser descartado em recipiente para resíduos infectantes após o procedimento.
  • Manipulação: O manuseio do cateter deve garantir que a porção distal (inserida no paciente) seja a parte processada.

Este procedimento é essencial para a investigação de bacteremias quando há suspeita clínica de infecção associada ao dispositivo, como sinais inflamatórios no local de inserção ou sinais sistêmicos de sepse

 Webinar - Cultura de Ponta de Cateter e Hemocultura

 

REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICA

ANVISA. Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Manual de microbiologia clínica para o controle de infecção relacionada à assistência à saúde. Módulo 1: Procedimentos laboratoriais. Brasília: ANVISA, 2004. Disponível em: https://www.gov.br/anvisa/pt-br. Acesso em: 31 maio 2026.

BRASIL. Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Manual de procedimentos básicos em microbiologia clínica para o controle de infecção hospitalar: Módulo I. Brasília: ANVISA/Ministério da Saúde, 2000. 56 p. Disponível em: https://bvsms.saude.gov.br/bvs/publicacoes/manual_procedimentos_microbiologiaclinica_controle_infechospitalar.pdf. Acesso em: 30 maio 2026.

CARROLL, K. C. et al. Manual of Clinical Microbiology. 12. ed. Washington, DC: ASM Press, 2019. 2 v.

TORTORA, G. J.; FUNKE, B. R.; CASE, C. L. Microbiologia. 12. ed. Porto Alegre: Artmed, 2017.

WADSWORTH, J.; FINEGOLD, S. M.; BARON, E. J. Bailey & Scott's Diagnostic Microbiology. 14. ed. St. Louis, MO: Elsevier, 2017.

 

 

QUESTÕES

  1. O que significa semear um material clinica?
  2. Qual  principio das técnicas de semeadura?
  3. O que significa repicar uma cultura?
  4. Como se obtém uma cultura pura.
  5. Qual importância da cultura pura no diagnóstico de doenças infecciosas?
  6. Para se identificar uma bactéria é necessário se obter uma cultura pura. Por que uma cultura mista conduz a erros de identificação?
  7. Em laboratório, os microrganismos são cultivados ou desenvolvidos em material nutriente denominado meio de cultura. O tipo de meio utilizado depende de vários fatores. Cite-os.
  8. Por que todo processo de semeadura deve ser feito em ambiente limpo e desinfetado, próximo de uma chama “azul” de um bico de Bunsen, ou então dentro de uma câmara de fluxo laminar;
  9. As placas semeadas devem ser incubadas com tampa invertida para não haver transpiração do meio sobre a tampa. O que pode ocorrer com as colônias se as placas forem incubadas com a tampa para cima?
  10. Comente sobre os seguintes métodos de conservação de bactérias: a) Liofilização, b) Congelamento, c) Transferência periódica para novos meios, d) conservação sob camada de óleo mineral

[1] Tomar cuidado para não ferir o meio de cultura.