CARACTERIZAÇÃO BIOQUIMICA

1. Introdução 

Após a obtenção de uma cultura pura e a realização da triagem morfológica inicial pela coloração de Gram, o laboratório de microbiologia clínica direciona seus esforços para a identificação definitiva da espécie, um passo essencial para o diagnóstico e a definição da conduta terapêutica. Embora a morfologia celular forneça pistas iniciais, a sobreposição de características entre diferentes gêneros torna o estudo do perfil bioquímico e metabólico — o fenótipo bacteriano — o método determinante para a identificação precisa, atuando como uma "impressão digital" química que reflete o conjunto enzimático específico de cada microrganismo.

O processo analítico inicia-se frequentemente com provas rápidas de triagem, como os testes da catalase e da oxidase, que permitem a rápida classificação taxonômica inicial dos isolados. Enquanto a catalase diferencia gêneros de cocos Gram-positivos ao decompor o peróxido de hidrogênio, a oxidase investiga a presença da enzima citocromo c oxidase, auxiliando na distinção entre importantes grupos bacterianos. Para bacilos Gram-negativos, especialmente as enterobactérias, utilizam-se sistemas em tubos que otimizam a rotina laboratorial, como o meio de Kligler e o caldo Ureia-Indol-TODA. O meio de Kligler permite a avaliação simultânea da fermentação de carboidratos, produção de gases e de gás sulfídrico, enquanto o sistema Ureia-Indol-TODA possibilita a verificação da atividade da urease, produção de indol e Triptofano Desaminase (TODA) a partir de um único inóculo.

Adicionalmente, a determinação da motilidade, realizada em meios semissólidos por meio de picada estrita, complementa a caracterização fenotípica ao revelar a presença de flagelos funcionais. Embora essas metodologias convencionais permaneçam como base fundamental do ensino e da prática microbiológica, a modernização laboratorial tem sido marcada por uma crescente automação. Analisadores automáticos, que operam com painéis miniaturizados e leitura fotométrica, permitem a identificação de alta acurácia e o teste de sensibilidade aos antimicrobianos simultâneos, integrando dados cinéticos a bancos de dados probabilísticos para a emissão de resultados rápidos e seguros. Toda essa sequência, que transita do isolamento e biossegurança à identificação bioquímica sofisticada, constitui o arcabouço lógico e prático necessário para a investigação microbiológica clínica.

2. POP para Triagem e identificação rápida de bactérias Gram-negativas

O Procedimento Operacional Padrão (POP) para a triagem e identificação rápida de bacilos Gram-negativos (BGN) em amostras clínicas é fundamental para guiar o início da terapia antibiótica direcionada. Abaixo, apresento um fluxo de trabalho laboratorial padronizado.

2.1. Objetivo e Escopo: Padronizar as etapas de coloração, triagem morfológica e testes bioquímicos rápidos para a identificação presuntiva de bacilos Gram-negativos de relevância clínica, visando a rapidez no resultado.

2. Materiais Necessários

• Microscópio óptico (objetiva de imersão 100x).
• Kit de coloração de Gram (Cristal violeta, Lugol, Álcool-acetona, Fucsina/Safranina).
• Meios de cultura: Ágar Sangue (AS) e Ágar MacConkey (AMC).
• Reagentes: Peróxido de hidrogênio (3%) para teste de Catalase, reagente de Kovacs para Indol (rápido).

2.3. Fluxo de Trabalho (Procedimentos)

Etapa 1: Preparação e Coloração de Gram

1. Realizar o esfregaço da amostra ou da colônia isolada em lâmina de vidro.
2. Proceder com a coloração de Gram (fixação pelo calor, aplicação dos corantes).
3. Observação microscópica: Identificar bacilos ou cocobacilos que se coram em rosa/vermelho (Gram-negativos).

Etapa 2: Semeadura em Meios Seletivos e Diferenciais

• Semear em Ágar MacConkey:
• Lactose positivo (colônias rosas/avermelhadas): Sugestivo de Enterobacteriaceae (ex: E. coli, Klebsiella spp.).
• Lactose negativo (colônias incolores/transparentes): Sugestivo de patógenos não fermentadores ou outros enterobactérias (ex: Pseudomonas, Salmonella, Shigella).

Etapa 3: Testes Bioquímicos Rápidos (Triagem)

2.4. Algoritmo de Identificação Rápida

1. Gram-negativo + Oxidase Positivo: Suspeita inicial de Pseudomonas aeruginosa ou outros não fermentadores.
2. Gram-negativo + Oxidase Negativo: Suspeita de Enterobacteriaceae.
   • Indol Positivo: Altamente sugestivo de Escherichia coli.
   • Indol Negativo: Testes adicionais necessários (Urease, Motilidade, etc.).
• Fermentador de Lactose (MacConkey rosa): Realizar prova de Indol.

2.5. Notas Importantes

• Segurança (Biossegurança): Todo o manuseio deve ocorrer em cabine de segurança biológica (CSB) de classe II, devido ao risco de aerossóis.
• Controle de Qualidade: Utilize sempre cepas controle (E. coli ATCC 25922 como controle de Gram-negativo) em cada nova bateria de testes ou lote de reagentes.
• Rapidez: Testes como Indol e Oxidase fornecem resultados em menos de 1 minuto, sendo cruciais para a agilidade clínica.

      Este POP oferece uma base para a identificação presuntiva. Para resultados confirmatórios, o laboratório deve seguir com métodos automatizados (VITEK, Phoenix) ou sistemas de automação molecular (MALDI-TOF MS) conforme a disponibilidade do serviço.

3.POP para Triagem e identificação rápida de bactérias Gram-negativas NÃO FERMENTADORES

  O procedimento operacional padrão (POP) para a triagem e identificação de bacilos Gram-negativos não fermentadores (BGNNF) diferencia-se da rotina de enterobactérias pela sua inaptidão em fermentar a glicose em condições anaeróbicas.

3.1. Etapas Preliminares e Triagem Inicial

1. Coloração de Gram: Confirmação de bacilos ou cocobacilos Gram-negativos.
2. Crescimento em Ágar MacConkey: Os não fermentadores tipicamente apresentam colônias incolores ou transparentes (lactose negativos), pois não fermentam a lactose.
3. Prova da Oxidase: É o teste de triagem mais importante.
• Oxidase Positivo: Sugestivo de Pseudomonas spp.
• Oxidase Negativo: Sugestivo de Acinetobacter spp. ou Stenotrophomonas maltophilia.

3.2. Testes Bioquímicos de Diferenciação

Após a triagem inicial, utiliza-se uma bateria de provas bioquímicas para confirmar o gênero e espécie. Os principais testes realizados incluem:

• Prova do TSI (Triple Sugar Iron): O meio permanece com a base e o topo vermelhos (alcalino/alcalino), indicando ausência de fermentação de glicose, lactose e sacarose.
• Motilidade: Avaliada em meio semi-sólido (SIM ou meio específico para motilidade). Pseudomonas costuma ser móvel; Acinetobacter é imóvel.
• Prova da Catalase: Geralmente positiva para a maioria dos BGNNF.
• Crescimento a 42°C: Importante para a identificação presuntiva de Pseudomonas aeruginosa.
• Testes Complementares: Ureia, citrato, descarboxilação de aminoácidos (lisina, arginina, ornitina) e utilização de carboidratos.

3.3. Algoritmo de Identificação (Resumo)

3.4. Considerações Operacionais

• Pureza da Cepa: Testes bioquímicos só devem ser realizados a partir de colônias isoladas e puras.
• Incubação: Diferente de algumas enterobactérias, a leitura de provas bioquímicas para não fermentadores pode exigir observação atenta, pois o metabolismo oxidativo é mais lento.
• Softwares de Apoio: Devido à complexidade taxonômica, recomenda-se o uso de sistemas automatizados (VITEK, Phoenix, MALDI-TOF MS) ou softwares de análise bioquímica (como ABIS ou PIBWin) para interpretação dos perfis obtidos.

Nota de Segurança: O manuseio destas cepas exige rigorosa técnica asséptica, visto que muitos BGNNF (como Acinetobacter baumannii e P. aeruginosa) possuem perfil de multirresistência a antimicrobianos (carbapenêmicos, entre outros), sendo patógenos críticos em ambientes hospitalares.

3.5. A interpretação dos resultados no MALDI-TOF MS (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization-Time of Flight Mass Spectrometry) baseia-se na comparação do espectro de massas obtido da amostra com um banco de dados de referência (biblioteca) contendo "impressões digitais" proteicas de microrganismos conhecidos. O processo de interpretação não é binário (sim ou não), mas sim probabilístico, expresso por um Score de Confiança.

3.5.1. O Score de Confiança (Valores de Corte)

Os sistemas comerciais (como Bruker Biotyper ou VITEK MS) utilizam faixas de pontuação para determinar a confiabilidade da identificação. Embora possam variar levemente entre fabricantes, a lógica padrão segue:

3.5.2. Processo de Interpretação e Validação

Quando o equipamento gera um resultado, a interpretação segue este fluxo:

1. Análise do Pico de Espectro: O sistema compara a abundância e massa dos picos proteicos (principalmente proteínas ribossômicas).
2. Verificação do Score:
• Se Score ≥ 2.0: Aceita-se a identificação como definitiva.
• Se Score entre 1.7 e 1.99: Recomenda-se a repetição da amostra (novo preparo) ou confirmação por métodos bioquímicos/moleculares complementares.
• Se Score < 1.7: Considera-se "No Identification" (NI). É obrigatório repetir o teste com um novo preparo (extração de proteínas) ou subcultura.

3.5.3. Desafios na Interpretação de Resultados

Algumas situações podem levar a resultados de baixo score ou identificações incorretas, exigindo análise crítica do microbiologista:

• Identificações de Gênero/Espécie Crípticas: Alguns grupos, como o complexo Burkholderia cepacia ou certas espécies de Acinetobacter (ex: A. calcoaceticus-baumannii complex), possuem perfis proteicos muito semelhantes. O software pode exibir o resultado como um "Complexo" ou indicar que não consegue distinguir as espécies.
• Contaminação ou Mistura: Se houver mais de uma espécie na mesma amostra, o espectro resultante será "sujo" (sobreposição de picos), fazendo com que o score caia drasticamente ou leve a uma identificação errônea.
• Qualidade da Colônia: Colônias muito velhas ou muito jovens podem não apresentar a assinatura proteica ideal. O uso de extração com ácido fórmico é mandatório para leveduras e algumas bactérias Gram-positivas, sendo frequentemente útil para melhorar a qualidade dos resultados em BGNNF de difícil identificação.
• Banco de Dados: Se a espécie não estiver cadastrada no banco de dados do aparelho, o MALDI-TOF nunca a identificará.

3.5.4. O que fazer quando o resultado não é satisfatório?

1. Recalibrar o equipamento: Verificar se a calibração com o padrão (ex: E. coli ATCC 8739) está vigente.
2. Repetir o preparo: Utilizar a técnica de "overlay" (adicionar ácido fórmico sobre a amostra antes da matriz) para romper melhor a parede celular e liberar proteínas.
3. Subcultura: Garantir que a amostra esteja em fase de crescimento logarítmico (colônias com 18-24h).
4. Métodos Alternativos: Se após a repetição o score continuar baixo, deve-se recorrer ao sequenciamento do gene 16S rRNA ou provas bioquímicas clássicas para identificação precisa.

4.POP para Triagem e identificação rápida de COCOS Gram-positivos

Este Procedimento Operacional Padrão (POP) estabelece o fluxo de trabalho para a identificação presuntiva de Cocos Gram-positivos (CGP), otimizando o tempo para a liberação de resultados críticos no laboratório de microbiologia clínica.

4.1. Triagem Inicial: Coloração de Gram e Catalase. Após o crescimento em meio sólido (Ágar Sangue é o meio ideal), o primeiro passo é a verificação microscópica e bioquímica básica:

1. Coloração de Gram: Confirmação da morfologia (cocos em cachos, cadeias ou pares) e coloração (Gram-positivos/azul-violeta).
2. Prova da Catalase: Fundamental para a divisão primária do grupo:
• Catalase Positivo: Gênero Staphylococcus e Micrococcus.
• Catalase Negativo: Gêneros Streptococcus, Enterococcus e Aerococcus.

4,2. Fluxo: Catalase POSITIVO (Estafilococos e similares)

1. Prova da Coagulase:
• Coagulase Positiva: Identificação presuntiva de Staphylococcus aureus.
• Coagulase Negativa: Outros estafilococos (CoNS).
2. Teste de Sensibilidade à Novobiocina (apenas se for CoNS de amostra urinária):
• Resistente: Staphylococcus saprophyticus.
• Sensível: Outros CoNS (ex: S. epidermidis).

4.3. Fluxo: Catalase NEGATIVO (Estreptococos e Enterococos). A diferenciação baseia-se no padrão de hemólise no Ágar Sangue e testes de sensibilidade:

4.4. Recomendações Técnicas

• Controle de Qualidade: Utilize sempre cepas ATCC para validar os testes:
• S. aureus (ATCC 25923) como controle de Catalase e Coagulase (+).
• S. pyogenes (ATCC 19615) como controle de Catalase (-).
• Biossegurança: Manipule todas as amostras em Cabine de Segurança Biológica (CSB) Classe II. Embora menos crítico que bacilos, S. aureus pode ser um patógeno oportunista grave.
• Identificação Definitiva: Este POP visa a triagem rápida. Amostras de sítios estéreis (sangue, LCR, biópsias) devem ser confirmadas via MALDI-TOF MS ou sistemas automatizados (VITEK/Phoenix) para precisão taxonômica e perfil de suscetibilidade.

      Este fluxo permite uma resposta rápida à equipe médica, essencial para o ajuste da antibioticoterapia empírica.

5.POP para Triagem e identificação rápida de BACILOS Gram-positivos (BGP)

Este Procedimento Operacional Padrão (POP) estabelece o fluxo para a triagem e identificação presuntiva de Bacilos Gram-positivos (BGP), um grupo heterogêneo que requer atenção especial devido à presença de patógenos críticos e organismos comensais.

5.1. Fluxo de Triagem Inicial. A identificação de BGP baseia-se na morfologia microscópica, prova da catalase e condições de crescimento.

Passo 1: Análise Morfológica (Gram)

• Bacilos longos: Sugestivo de Bacillus spp.
• Bacilos em paliçada/letras chinesas: Sugestivo de Corynebacterium spp.
• Bacilos delicados: Sugestivo de Listeria spp. ou Erysipelothrix spp.
• Presença de esporos: Confirmar via coloração de Wirtz-Conklin (esporos coram-se em verde, o corpo do bacilo em rosa).

Passo 2: Prova da Catalase

• Catalase Positivo: Bacillus spp., Corynebacterium spp., Listeria monocytogenes, Nocardia spp.
• Catalase Negativo: Erysipelothrix rhusiopathiae, Lactobacillus spp., Actinomyces spp.

• Algoritmo de Identificação por Grupo

5.3. Testes Bioquímicos Estratégicos

1. Prova da Motilidade (Meio semi-sólido): Crucial para Listeria monocytogenes: apresenta motilidade característica a 25°C e é imóvel a 37°C.
2. Produção de H₂S (Meio TSI ou SIM): Erysipelothrix produz $H_2S$ (escurecimento do meio), diferenciando-o de Listeria.
3. Prova da Urease: Auxilia na diferenciação de espécies de Corynebacterium (ex: C. urealyticum é urease positivo).
4. Crescimento em Caldo NaCl 6,5%: Listeria cresce em altas concentrações de sal, o que auxilia na sua diferenciação.

5.4. Notas de Segurança e Controle

• Biossegurança: Atenção: Bacillus anthracis (bioterrorismo) e Listeria monocytogenes (patógeno grave) exigem manuseio rigoroso em Cabine de Segurança Biológica (CSB) Classe II. Nunca realize provas de motilidade ou testes em bancada aberta se houver suspeita de patógenos de alto risco.
• Controle de Qualidade:
• Listeria monocytogenes (ATCC 7644) – Controle de motilidade e catalase.
• Bacillus subtilis (ATCC 6633) – Controle de esporulação.
• Confirmação: BGP raramente permitem identificação definitiva apenas por bioquímica clássica. Após a triagem, o isolado deve ser submetido ao MALDI-TOF MS ou sistemas automatizados para confirmação de espécie, dada a proximidade taxonômica de muitas espécies comensais da microbiota humana.

Dica de Prática Laboratorial: Para Corynebacterium, observe a morfologia colonial em Ágar Sangue: colônias pequenas, acinzentadas, não hemolíticas e com aspecto de "cabeça de alfinete" são clássicas, mas exigem correlação clínica, pois a maioria dos isolados clínicos são contaminantes de pele.

6. PROVAS BIOQUÍMICAS