Reação “in vitro” ou  “in vivo” (no plasma, líquor, intimidade dos tecidos e pele) que revela a presença do antígeno ou do anticorpo

IMPORTÂNCIA:

• Diagnóstico imunológico
• Evolução e tratamento ( critério e cura e recaída)
• Prognóstico ( cura sorológica)
• Inquéritos epidemiológicos
• Análise de antígenos e de anticorpos

TÍTULO DE UM SORO: Teor em anticorpos. Amboceptor

REPETIÇÃO DAS PROVAS:Ex.  Viroses e Riquétsioses, com intervalo de 14 dias. Verificar elevação 4 vezes do título original.

INTERPRETAÇÃO CUIDADOSA COM OS DADOS CLÍNICOS:  “Reações cruzadas” podem ocorrer ( antígenos comuns ).

PROVAS INTRADÉRMICAS: Persistem positivas e as sorológicas se negativam com o tempo. A chamada “cicatriz sorológica” pode ocorrer.

TIPOS DE REAÇÕES

I - REAÇÃO DE  AGLUTINAÇÃO (FLOCULAÇÃO CELULAR )

• Reação de Widal - Febre tifóide e paratifóide . Antígenos O, H, e Vi.

Salmonella typhi

Salmonella paratyphi A

Salmonella paratyphi B

• Reação de Weil-Felix: Riquetsioses, exceção da febre Q.

                                           Proteus OX₂, OXK, OX1

• Reação de Paul-Bunnel-Davidsohn: Mononucleose

hemácia de carneiro - 1ª fase

Rim de cobaio/ hemácias de boi - 2ª fase

(Absorção de aglutinina)

• Mono-teste para mononucleose: hemácias formalizadas de cavalo
• Reação de Huddleson: Brucelose ( Brucella abortus )
• Reação de Rubino: Mycobacterium leprae ( hemácia de carneiro formalizada)
• Tipagem de bactérias: soros mono e polivalentes
• Doença de Weil - Leptospira ictero-haemorrhagiae

II -  REAÇÕES DE AGLUTINAÇÃO E DE PRECIPITAÇÃO

            O antígeno figurado ou em micelas é “sensibilizado” com polissacarídeos, ácido tânico, benzidina bisdiazotada, difluordinitrobenzeno, enzimas ou outras substâncias. Ex. Chagas, Esquistossomose, teste de látex p/ diagnóstico da gravidez.

            A imunoprecipitação em gel nada é mais do que uma interação de Ag e Ac no interior de um suporte neutro, constituído por ágar ou ágarose. Esta técnica combina difusão com precipitação. A difusão dos componentes da reação pode ser unidirecional ou radical, passiva ou impulsionada por um campo elétrico. Os componentes da reação são colocados em regiões opostas, dentro de orifícios previamente preparados, em placa ou lâmina de ágarose, de forma que eles possam se difundir livremente um em direção ao outro, formando linha de precipitação, facilmente visível, quando atingem uma relação ótima de Ag Ac (ponto de equivalência ).

A imunodifusão radical dupla ou de Ouchterlony é uma técnica de imunoprecipitação em gel, onde os componentes da reação se difundem radical e passivamente, formando linhas de precipitação no ponto de equilíbrio Ag X Ac.

 III - REAÇÕES DE FLOCULAÇÃO MICELAR

            Precipitação em tubos, placas, gel-de-ágar ou gel-de-amido.

• Reação de Muniz & Freitas: Doença de Chagas
• Reação de Fava Netto: Blastomicose sul americana
• Reação de Ouchterlony : Dupla difusão em gel-de-ágar
• Imuno-eletroforese (Grabar & Williams)
• Prova de Ascoli : Carbúnculo
• Reação de VDRL: Treponematose
• Sistemática bacteriana
• Reação de Uhlenhuth: Medicina legal e higiene

 IV - REAÇÕES DE FIXAÇÃO DO COMPLEMENTO

Antígeno deve possuir bom poder fixador e não impediente

Soro inativado ( 56ºC - 30 min.)

Complemento (C’) ou alexina - 1ª fase

(O complexo Ag-Ac  liga com o complemento)

Hemolisina

Hemácia de carneiro - 2ª fase

Ausência de hemólise - Reação positiva

Presença de hemólise - Reação negativa

V - REAÇÃO DE NEUTRALIZAÇÃO

            Aplicada principalmente para diagnóstico de viroses. O antígeno é neutralizado pelo anticorpo, perdendo seu poder infectante para ovos, para cultura de tecidos e para animais de laboratório.

• Diagnóstico da Poliomielite
• Diagnóstico da febre amarela

 VI -  REAÇÃO DE IMUNOFLUORESCÊNCIA

            A imunofluorescência tem sido utilizada com sucesso para investigação de numerosos problemas imunológicos ( destino do antígeno infectado, localização e titulação de anticorpos) e virológicos ( localização dos vírus).

• Diagnóstico bacteriológico das diarréias infantis por Escherichia coli patogênicas,
• Diagnóstico da coqueluche,
• Diagnóstico das meningites por H. influenzae,
• Caracterização dos estreptococos do grupo A,
• Pesquisa do corpúsculo de Negri,
• Demonstração do vírus da pneumonia atípica primária, etc.

IMUNOFLUORESCÊNCIA DIRETA: É o método pelo qual se pode detectar antígenos figurados através de soro hiperimunes específicos, conjugados  com o isotiocianato de fluoresceína.

IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA: Baseia-se no fato dos anticorpos serem imunoglobulinas. Um soro anti-globulina ( soro de Coombs ) reage com as globulinas de uma mesma espécie animal. Se um soro anti-globulina humana for marcada com fluoresceína, obtêm-se conjugado útil para evidenciação dos anticorpos em soros humanos.

VII - IMUNOELETROFORESE

            A imunoeletroforese é uma técnica que combina difusão passiva com ativa. Neste tipo de reação a interação antégono versus anticorpos (Ag X Ac) ocorre quando o Antígeno é colocado em um orifício no centro da lâmina e submetido a uma corrente elétrica. Após o fracionamento do Antígeno de encontro ao  Anticorpo, formando linhas de precipitação no ponto de equivalência.

CONTRAIMUNOELETROFORESE (CIE)

 A contraimunoeletroforese é uma técnica que consiste em submeter Ag e Ac a uma corrente elétrica

           A técnica eletroforese SDS - PAGE é utilizada para verificar se uma proteína está pura ou se tem subunidades. As subunidades das proteínas podem ser separadas e seus pesos moleculares determinados por eletroforese em gel uni-dimensional na presença de detergentes como o dodecil sulfato de sódio (SDS) ou “spots” em gel bi-dimensional.

            A eletroforese pode ser usada também para recuperar e isolar grandes quantidades de proteínas através de eletroeluição.

            Após a solubilização das proteínas pelo aquecimento na presença de SDS e 2 mercaptoetanol ( agente químico que reduz pontes de enxôfre) uma alíquota da solução de proteínas é aplicada a um gel e as proteínas individuais ou suas subunidades são separadas eletroforeticamente. 

Uma mistura antigênica deve ser solubilizada, geralmente com dodecil sulfato de sódio ( SDS), uréia, e/ou agentes redutores tais como 2 - mercaptoetanol. Após a solubilização, o material é separado pela eletroforese em gel de poliacrilamida(SDS-PAGE).Os antígenos são então transferidos eletroforeticamente para um filtro de nitrocelulose, ficando ligados irreversivelmente. O filtro é então bloqueado para prevenir ligação não específica de anticorpos e colocado para reagir com o anticorpo de interesse. O anticorpo é dectado por um conjugado anti-imunoglobulinas (Ig) marcado com peroxídase e visualizado incubando o papel de filtro na presença de um substrato precipitável. O anticorpo também pode ser detectado através da proteína A marcada com I¹²⁵.

 VIII - REAÇÕES DE INIBIÇÃO DA HEMAGLUTINAÇÃO

Gripe, sarampo, caxumba ( Mixovírus ) 

IX - TÉCNICA IMUNOENZIMATICAS - ELISA

       (ENZYME-LIKE IMMUNOSORBENTE ASSAY)

            Antígenos e anticorpos podem ser detectados e quantificados utilizando-se o ensaio imunoenzimático tipo ELISA.

• ELISA para detecção e quantificação de anticorpos
• ELISA tipo sanduiche

            O teste de ELISA clássico pode ser usado para quantificação de anticorpos . Para a reação necessita-se de uma fase sólida (placas de poliestireno) onde o antígeno é adsorvido. A amostra contendo o anticorpo a dosar é incubada com o antígeno insolubilizado. Após lavagens para retirada de anticorpos que não reconheceram o antígeno, adiciona-se um “conjugado” (anti-imunoglobulina-Enzima), que se ligará aos sítios livres do anticorpo.

            Por este modelo, a qualidade do conjugado ligado à fase sólida é proporcional à quantidade  de anticorpos ligados ao antígeno adsorvido no plástico. Finalmente, a atividade enzimática é revelada por um substrato - ELISA, possibilitando em investigações mais elaboradas, o uso  de conjugados classe específica para determinar anticorpos das classes IgM, IgA e IgE.

       Há vários métodos para ligar covalentemente haptenos, proteínas e carboidratos a proteínas. No momento, conjugados enzima-proteína são preparados principalmente usando periodato de sódio ou glutaraldeído. A ligação é estável, não se alterando o sítio antigênico do anticorpo, nem o sítio ativo da enzima.