PESQUISA DE Escherichia coli O157:H7
BRASIL. Instrução Normativa n°. 62 de 26 de agosto de 2003. Análises microbiológicas para controle de produção de origem animal e água. Diário Oficial da União, Brasília, 18 set. 2003.
1. OBJETIVOS E ALCANCE
Estabelecer procedimento analítico para a pesquisa de Escherichia coli O157:H7 em alimentos e água.
2. FUNDAMENTOS
2.1 Enriquecimento seletivo: Baseia-se na incubação de 25 ± 0,2 g ou mL da amostra em solução salina peptonada tamponada adicionada de vancomicina, cefixime e cefsulodin (SPT-VCC), por 6 horas em temperatura de 36 ± 1ºC.
O efeito seletivo é exercido pela associação de vancomicina, cefixime e cefsulodin, que visa à inibição da flora acompanhante, especialmente Proteus sp e Aeromonas sp.
2.2 Separação imunomagnética: Baseia-se em duas ações principais: a captura por ligação imunológica e a separação por ação de forças magnéticas. A aplicação dessas duas ações leva à obtenção de efeitos de concentração e purificação do microrganismo-alvo.
O sistema de separação imunomagnética utiliza microesferas superparamagnéticas cobertas uniformemente com uma fina camada polimérica, biologicamente inerte, que protege o material magnético e oferece uma área de superfície definida para adsorsão ou acoplamento de várias moléculas onde estão ligados anticorpos policlonais anti E coli O157. Na língua inglesa, estas microesferas são denominadas de “beads”.
2.2.1 Lavagem das microesferas: Baseia-se em três passos de lavagem com solução salina tamponada, adicionada de tween 20, realizados com a finalidade de retirar microrganismos inespecificamente ligados às partículas imunomagnéticas.
2.3 Isolamento: Baseia-se na semeadura da alíquota imunomagneticamente separada sobre a superfície seca de ágar MacConkey Sorbitol (MCS), o que permite que as células aderidas às microesferas formem colônias.
Normalmente mais de uma célula se adere a cada partícula imunomagnética, o que pode resultar em colônias originárias de mais do que uma célula aderida.
No ágar MCS, o efeito seletivo é exercido pelos sais biliares e pelo cristal violeta presentes no meio, que atuam inibindo a flora Gram positiva. A fermentação do sorbitol é evidenciada pela viragem da cor do indicador de pH (vermelho neutro) para vermelho intenso.
2.4 Identificação bioquímica: Baseia-se na inoculação das culturas suspeitas em uma bateria miniaturizada de testes padronizados. Os microtubos, contendo substratos desidratados para cada teste, são reidratados pela adição da suspensão do microrganismo teste em diluente específico para esta finalidade.
Durante a incubação a 36 ± 1ºC, devido ao metabolismo bacteriano, ocorrem mudanças de coloração dos indicadores contidos no substrato.
Novobiocina;
Solução aquosa de Cefixime 1%;
Solução de Sorbitol 10%;
Solução de Celobiose 10%;
Solução de Dulcitol 10%;
Reativo para oxidade (N'N'N'N'-tetrametil-parafenileno-diamina ou oxalato de para-amino-dimetilanilina) ou tiras para teste de oxidase;
Cloreto férrico;
Reativo de Kovac´s(ou, opcionalmente, reativo de Ehrlich);
Hidróxido de potássio;
Alfa naftilamina 0,5%;
Alfa naftol;
Ácido sulfanílico 0,8%;
Solução aquosa de Cloreto de Cálcio 10 mmol;
Partículas imunomagnéticas de 280nm cobertas com anticorpo
antiEscherichia coli O157;
Sistema miniaturizado para identificação de Enterobactérias.
Em alguns testes, a leitura final somente se realiza após a adição de reativos específicos.
2.5 Látex teste
O látex-teste para identificação de Escherichia coli O157 consiste de dois reagentes à base de látex. O primeiro é formado por partículas de látex, cobertas com anticorpo específico produzido em coelho (látex reagente); o segundo é o reagente controle, que é formado por partículas de látex, cobertas com globulinas de coelho préimune (látex controle). Quando cultivos de Escherichia coli O157 são submetidos ao látex-teste, ocorre aglutinação do látex-reagente e não do látex-controle.
2.6 Provas complementares
Outras provas complementares são realizadas com a finalidade de identificar e diferenciar Escherichia coli O157:H7 de outros membros de sua espécie, tais como motilidade, produção de â-Dglicuronidase, e fermentação de carboidratos.
A verificação da produção de α-hemolisina destina-se à obtenção de um indicativo sobre a verocitotoxigenicidade do isolado, já que existe uma forte correlação positiva entre a produção desta hemolisina e de verotoxina.
3. REAGENTES E MATERIAIS
Vidraria e outros materiais básicos para laboratórios de microbiologia de alimentos;
Ágar MacConkey-sorbitol (MCS);
Ágar eosina azul de metileno (EMB);
Ágar cristal violeta vermelho neutro bile (VRBA);
Ágar soja triptona, com CaCl2 e eritrócitos lavados de carneiro (ASSTCa);
Ágar soja triptona;
Ágar estoque;
Ágar motilidade;
Solução salina peptonada tamponada com vancomicina, cefsulodin e cefixime (SPT - VCC);
Caldo verde brilhante-bile-lactose 2% - metilumbeliferil-glicuronídeo (BRILA-MUG);
Caldo verde brilhante-bile-lactose 2%;
Caldo vermelho de fenol-base;
Caldo soja triptona;
Caldo EC modificado com novobiocina (Caldo EC + n);
Solução salina tamponada pH 7,2;
Solução salina tamponada 1% adicionada de 0,02% de tween 20;
Solução salina 0,85%;
Solução salina peptonada 0,1%;
Meio SIM;
Solução aquosa de Vancomicina 0,8%;
Solução aquosa de Cefsulodin 1%;
4. EQUIPAMENTOS
Equipamentos básicos obrigatórios para laboratórios de microbiologia; Câmara UV (366 nm);
Misturador de Amostras;
Separador Imunomagnético;
Pipetadores automáticos ajustáveis (5-50, 50-200, 100-1000µL) e ponteiras correspondentes, com barreira.
5.PROCEDIMENTOS
5.1 Pesagem e preparo da amostra: Pesar assepticamente 25 ± 0,2 g ou pipetar 25 ± 0,2 mL de amostra em sacos de “stomacher” ou frascos Erlenmeyer estéreis, seguindo as orientações contidas no Anexo II, “Diluições e soluções”, deste Manual.
5.2 Procedimentos de controle: Aplicar os procedimentos de controle específicos estabelecidos pelo laboratório.
5.3 Pré-enriquecimento: A cada alíquota adicionar 225 mL de SPT-VCC e incubar por 6 horas a 36 ± 1ºC.
5.4 Separação imunomagnética: Após as 6 horas de incubação, de cada amostra pré-enriquecida, transferir 1 mL para tubo eppendorf com tampa apegada.
Adicionar a cada eppendorf 20 µL de “beads” 280nm cobertas com anticorpo policlonal antiEscherichia coli O157.
Após homogeneização, por suaves inversões sucessivas do eppendorf, dispor os tubos no equipamento misturador onde deverão permanecer por 30 minutos em baixa velocidade.
Em seguida, colocar os tubos no separador com suporte magnético já acoplado, onde devem permanecer por 5 minutos.
Sem retirar os tubos do separador magnético, extrair todo o líquido dos tubos eppendorf, com o auxílio de pipetas Pasteur ou descartáveis com bulbo, estéreis, tomando o cuidado para não tocar na parede onde as partículas imunomagnéticas estão aderidas.
Descartar o líquido em recipiente com desinfetante.
Retirar o suporte magnético do separador. A cada tubo, adicionar 1 mL de solução salina peptonada 1% tamponada - 0,02% de tween 20 e misturar delicadamente por repetidas inversões.
Recolocar o suporte magnético no separador e deixar por mais 5 minutos.
Repetir esta operação por mais 2 vezes e finalizar com uma lavagem adicional com PBS sem tween, sempre descartando o líquido em recipiente com desinfetante.
Depois da retirada total do líquido, suspender os “beads” em 20 µL de PBS. Esta será denominada “fração imunomagneticamente separada” ou FIS.
5.5 Semeadura, seleção e isolamento: Inocular no centro de uma placa com ágar MCS, previamente seca, 10 µL da FIS. Espalhar com auxílio de alça de Drigalski ou bastão tipo “hokey”.
Partindo dos 10 µL restantes da FIS, inocular com alça de 1 µL sobre outra placa com ágar MCS, de forma a obter colônias isoladas.
Incubar a 36 ± 1ºC por 24 a 30 horas.
Utilizando estereoscópio com luz oblíqua incidente sobre a colônia, selecionar de 3 a 5 colônias sorbitol negativas com superfície suavemente ondulada, com bordas em forma de "saia", irregulares, achatadas, e repicar em placas com ágar VRBA e ágar BEM. Também repicar para tubos com ágar estoque inclinado.
Incubar a 36 ± 1ºC por 18 a 24h. Após o período de incubação, observar a pureza e características das culturas e, quando necessário, reisolar em superfície seca de ágar MCS.
Quando, após dois procedimentos de reisolamento, não forem obtidos cultivos puros, repicar para tubos com caldo EC+n, ou com caldo verde brilhante bile lactose 2% e incubar por 18 a 24 horas a 36 ± 1ºC, inoculando posteriormente sobre a superfície seca de ágar MCS e de ágar EMB, independentemente da produção de gás nos tubos de Durhan.
Incubar a 36 ± 1ºC por 18 a 24 horas.
Utilizando estereoscópio com luz oblíqua incidente sobre a colônia, selecionar de 3 a 5 colônias sorbitol negativas com superfície suavemente ondulada, com bordas em forma de "saia", irregulares, achatadas, e repicar em placas com ágar VRBA e ágar EMB.
Também repicar para tubos com ágar estoque inclinado.
Incubar a 36 ± 1ºC por 18 a 24 horas.
5.6 Teste da oxidase: A partir dos cultivos puros em ágar estoque inclinado, usando palitos de madeira estéreis ou de plástico descartável, alça de platina ou pipeta de Pasteur, realizar a prova da oxidase espalhando a cultura sobre papel filtro impregnado com o reativo para oxidase (podem também ser utilizadas tiras para oxidase, comercialmente disponíveis).
O aparecimento de cor azul intensa (N´ N´ N´ N´ -tetrametil-parafenileno-diamina) ou vermelho escuro (oxalato de para-amino-dimetilanilina) é indicativo de reação positiva.
Não utilizar alças de níquel-cromo ou de aço para realizar a prova de oxidase.
Todas as cepas de Escherichia coli O157:H7 apresentam resultado negativo na prova de oxidase.
As culturas que apresentam resultado positivo não pertencem à família Enterobacteriaceae, portanto não necessitam ser submetidas a testes complementares para Escherichia coli 0157:H7.
5.7 Teste de aglutinação de látex: Submeter as culturas puras obtidas conforme item 5.5 ao teste de aglutinação de látex, suspendendo-as em duas gotas de solução salina colocadas sobre o cartão de teste que acompanha o kit.
À primeira, misturar uma gota do látex reagente e sobre a outra uma gota do látex controle. Misturar por um minuto e observar aglutinação.
Considerar como positivas as culturas que, em um minuto ou menos, apresentarem aglutinação apenas no látex reagente. Para os controles positivo e negativo, utilizar os controles que acompanham o kit.
As culturas que apresentarem resultado negativo no teste de aglutinação de látex devem ser descartadas.
5.8 Testes adicionais
5.8.1 Verificação da motilidade das culturas suspeitas.: A partir das culturas puras, em ágar estoque inclinado, que apresentarem reação positiva frente ao látex reagente e negativa frente ao látex controle, repicar para tubos contendo ágar motilidade modificado, utilizando agulha de inoculação.
Incubar a 36 ± 1ºC por 18 a 24 horas. Observar o tipo de crescimento: difuso (motilidade positiva) ou apenas na linha de inoculação (motilidade negativa).
As cepas de Escherichia coli O157:H7 apresentam motilidade positiva, enquanto que a E.coli ATCC 25922 apresenta motilidade negativa.
5.8.2 Verificação da produção de â-D-glicuronidase e de gás em caldo BRILA-MUG.
A partir das culturas isoladas conforme item 5.5, repicar para tubos com caldo verde brilhante bile-lactose-metilumbeliferil-glicuronídeo (BRILA-MUG), com tubos de Durhan invertidos.
Incubar a 36 ± 1ºC por 24 a 48 horas.
Observar a produção de gás nos tubos de Durhan. Anotar os resultados.
Em câmara de UV (366nm), verificar a formação de 4-metilumbeliferona a partir do MUG. Considerar como positivo para â-Dglicuronidase as culturas que produzirem fluorescência no meio de cultura.
A Escherichia coli O157:H7 não produz â-D-glicuronidase, portanto não se observa fluorescência no caldo BRILA-MUG.
A Escherichia coli ATCC 25922 produz fluorescência (reação positiva) neste meio.
OBS: A cultura de E.coli O157:H7 ATCC 43888 (não toxigênica) não produz gás no caldo verde brilhante lactose 2%, enquanto que as E.coli O157:H7 verotoxigênicas ATCC 43889, ATCC 43890 e ATCC 43894 são capazes de produzir gás neste meio.
5.8.3 Verificação da fermentação do sorbitol, da celobiose e do dulcitol
A partir das culturas isoladas conforme item 5.5, repicar para tubos contendo 3 mL de caldo vermelho de fenol base adicionado, separadamente, de sorbitol, celobiose e de dulcitol (esterilizados por filtração), de forma a obter uma concentração final do açúcar de 0,1%.
Incubar os tubos a 36 ± 1ºC por 24 a 30 horas. Após incubação, observar a produção de ácido, evidenciada pela viragem do indicador vermelho de fenol para amarelo nas culturas fermentadoras dos açúcares presentes.
Os resultados esperados estão na tabela abaixo:
Cultura Sorbitol Celobiose Dulcitol
Escherichia coli O157:H7 - - +
Escherichia hermannii - + -/+
Escherichia fergusonii - + ±
Escherichia coli + -* ±
± : 60% são pos. -/+ : 19% são positivas -*: 2% são positivas
5.8.4 Verificação da produção de enterohemolisina: A partir das culturas puras obtidas conforme item 5.5, repicar em estrias para a superfície seca de ágar soja triptona, com cloreto de cálcio e eritrócitos de carneiro (ASSTCa). Para preparar o ASSTCa, a cada 100mL de ágar soja triptona adicionar 1 mL CaCl2 1M e 5 mL de eritrócitos lavados de carneiro.
Incubar a 36 ± 1ºC por 4 horas. Verificar atividade hemolítica e registrar os resultados obtidos. Reincubar até 24 horas repetindo a leitura.
Considerar como positivas para produção de enterohemolisina as culturas que não produzirem hemólise em 4 horas e apresentarem reação hemolítica característica de alfa-hemolisina (coloração esverdeada ao redor das colônias) após 24 horas de incubação.
A grande maioria das cepas de Escherichia coli O157:H7 verotoxigênicas são alfa-hemolíticas.
5.9 Provas Opcionais: Adicionalmente, podem ser utilizados sistemas miniaturizados de provas bioquímicas para identificação de enterobactérias, aprovados para uso pela CLA/MAPA.
5.9.1 Sistema miniaturizado para identificação de enterobactérias: Repicar, para tubos com ágar estoque inclinado, as culturas que apresentaram reação positiva frente ao látex reagente, negativas frente ao látex controle, motilidade positiva, β-D-glicuronidase negativa, com ou sem produção de gás a partir da lactose, não fermentadoras do sorbitol e da celobiose, e capaz de fermentar o dulcitol.
Incubar a 36 ± 1ºC por 18 a 24 horas.
Seguir as recomendações do fabricante do sistema utilizado.
6. RESULTADOS
Considerar o resultado positivo para Escherichia coli O157:H7 as amostras em que os isolados se comportarem como abaixo descrito:
a) Colônia característica de E.coli em VRBA e BEM;
b) Sorbitol negativo no MCS;
c) Celobiose negativa no caldo vermelho de fenol;
d) Dulcitol positivo no caldo vermelho de fenol;
e) Sorbitol negativo no caldo vermelho de fenol;
f) Aglutinação positiva frente ao látex reagente em um minuto;
g) Aglutinação negativa frente ao látex controle;
h) Motilidade positiva.
i) â-D-glicuronidase negativa
j) Não hemolítica em 4 horas
k) Alfa-hemolítica em 24 horas (presuntivo para verotoxina)
l) Perfil bioquímico correspondente a Escherichia coli no sitema para identificação de enterobactérias.
As culturas que se comportarem como Escherichia coli O157:H7 devem ser mantidas pelo laboratório e encaminhadas à Instituição de Referência para enterobactérias, designada pela CLA para sorotipificação, inclusive com soro flagelar H7, e teste de verotoxigenicidade.
Os resultados de confirmação sorológica e de verotoxigenicidade podem demorar um tempo relativamente grande. Por este motivo, emitir o resultado de análise considerando os resultados obtidos no laboratório. Quando o resultado sorológico confirmar a presença de E.coli O157:H7 (verotoxigênica ou não), comunicar por escrito ao responsável pelo SIF que encaminhou a amostra para análise.
Manter arquivo de todas informações sorológicas realizadas pela Instituição de Referência.
6.1 Expressão do resultado; Expressar o resultado como:
Pesquisa de Escherichia coli O157:H7 - Presença /25 g ou mL;
ou
Pesquisa de Escherichia coli O157:H7 - Ausência/25 g ou mL.
7. BIBLIOGRAFIA CONSULTADA
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