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Existe duas maneiras de chegar a algum lugar. Uma de forma aleatória, com tentativas de acertos e erros; e, outra, orientada e supervisionada por alguém que conhece o caminho das pedras.




 Prof.Dr.Luis Carlos Figueira de Carvalho
Isolamento de Estafilococos

ISOLAMENTO E CARACTERIZAÇÃO DE ESTAFILOCOCOS

 Objetivo: Demonstrar as características morfológicas e propriedades bioquímicas dos estafilococos

Princípio: Morfologicamente apresentam-se nos esfregaços corados pelo Gram em forma de “cachos de uva”, sendo esta uma característica peculiar que os diferenciam dos estreptococos.

Podem ser isoladas com relativa facilidade de coleções purulentas da nasofaringe, lesões de pele e aparelho genital.

Dentre as espécies de estafilococos, sem dúvida alguma o Staphylococcus aureus é potencialmente a espécie mais virulenta, onde, em ágar sangue, geralmente apresenta-se hemolítico.

São vários os métodos de diferenciação das espécies de estafilococos; entretanto, o teste da coagulase é o mais indicado e adequado para a caracterização do S. aureus, visto que somente esta espécie apresenta reação positiva, configurando portanto  esta reação como prova da patogenicidade dos estafilococos.

As outras espécies de estafilococos, denominadas de coagulase-negativa, somente nas últimas décadas têm sido implicadas na etiologia de processos infecciosos. Entretanto, os métodos ordinários de identificação empregados na microbiologia são incapazes de detectar isoladamente as doze espécies coagulase-negativa, ficando restrito o diagnóstico presuntivo ás espécies S. epidermidis e S. saprophyticus.

Material: Placas de ágar-sangue, de Chapman-Stone e ágar DNAse, cultivadas S.aureus de um lado e S.epidermidis do outro lado; Lâmina de microscópio, bico de Bunsen, bateria de corante de Gram, tubinhos (120mm), 2 pipetas de 2ml, 2 tubos contendo 2ml de salina, água oxigenada a 3%, alça de platina, plasma de coelho, Solução  de bromocresol, placa contendo ágar Mueller-Hinton, disco de novobiocina, ácido clorídrico 1N, pipeta Pasteur.

Método:  Observar as placas com cultura bacteriana, anotar as características coloniais e realizar os seguintes testes:

  • Coloração de Gram
  • Prova da catalase:
  • Prova da Coagulase:
  • Fermentação do manitol:
  • Tolerância ao NaCl
  • Sensibilidade a novobiocina

 Coloração de Gram

  • Fazer esfregaços em lâminas e fixar pelo calor
  • Cobrir a área do esfregaço com a solução  de cristal-violeta  por cerca de 1min.;
  • Lavar com água corrente e escorrer o excesso de água;
  • Cobrir a área do esfregaço com a solução de iodo durante cerca de 1 minuto;
  • Descorar a lâmina com a mistura álcool-acetona, até que o solvente escorra incolor;
  • Cobrir o esfregaço com a solução de safranina  por cerca de 30 segundos;
  • Lavar com água corrente;
  • Deixar secar ao ar .

 Os estafilococos são visualizados como cocos Gram-positivos (roxo) isolados e agrupados em forma de cachos de uva

Prova da Catalase

              A catalase presente na maior parte das bactérias atua na reação:

2H2O2    catalase     2H2O + O2

                 Colocar em um tubinho (120mm) 1 ou 2 ml de água destilada, emulsionar quantidade suficiente de colônias de Staphylococcus aureus para obter uma suspensão espessa; acrescentar-lhe 3 gotas de água oxigenada a 3%. Não agitar. O desprendimento de bolhas de gás indica a presença de catalase.

 Prova da coagulase:

                 Enzima que, reagindo com um co-fator existente no plasma de certas espécies (coelho, cavalo, humano), transforma o fibrinogênio em fibrina.

                O co-fator plasmático é indistinguível da protrombina, porém a enzima se diferencia da tromboquinase pois, ao contrário desta última, não requer a presença de íons Ca+2, nem dos fatores 5, 6 e 7 para sua ativação.

                Teste: Misturar 0,5ml de cultura em caldo simples ou de suspensão espessa de estafilococos a 0,25ml de sangue total ou plasma de coelho oxalatado a 0,2% ou citratado a 1%. Leitura após 2 a 4 horas a 37ºC.

                Prova presuntiva em lâmina: Emulsionar homogeneamente uma alça do induto bacteriano em uma gota de salina. Misturar uma alça de plasma e agitar circularmente. Reação positiva: formação de grumos em 2 segundos. Reação negativa será controlada pelo teste em tubo.

 Plasma de coelho 1/5 (para prova de coagulase)

Sol. de citrato de sódio a 3,8%....  2,5ml

Sangue de coelho........   10,0ml

 

Separar o plasma (centrifugar a 2000 rpm durante 20min.), diluir a 1/5 em solução fisiológica.

 Fermentação do Manitol e Tolerância ao NaCl

 Semear a bactéria no meio de Chapman-Stone (item 8.5.15). O meio fornece três respostas: a) pigmentação; b) fermentação da manita – adicionar 1 gota de sol. de bromocresol às áreas de onde se removeram colônias tipicamente pigmentada; c) produção de gelatinase – halo claro em torno das colônias

Sensibilidade à Novobiocina

                Fazer uma suspensão da bactéria em salina estéril. Com swab estéril semear por espalhamento a bactéria sobre o meio de Mueller-Hinton. Colocar um disco de novobiocina no centro da placa. Incubar a 37ºC por 24 a 48horas. A leitura é feita pela observação da presença (S) ou não (R) de zona de inibição ao redor do disco.

 Desoxirribonuclease (DNAse)

 

“DNase Test Ágar” (Difco ou BBL) ... 42,0g

Água destilada ................... 1000ml

 Fundir e esterilizar a 120°C, 15 minutos. Distribuir em placas de Petri.

Inocular em pontos definidos, sem estriação. Após crescimento, revelar com solução de ácido Clorídrico 1N. Uma zona transparente em torno do crescimento, após opacificação do ácido nucléico residual pelo ácido clorídrico, indica um teste positivo.

Resultados:

  •  Em ágar sangue as colônias de estafilococos apresentam-se com coloração branca ou amarelada, opacas, cremosas e convexas, sendo que algumas cepas bacterianas produzem  beta-hemólise.
  • O primeiro passo para a identificação presuntiva das  colônias de estafilococos consiste na confecção de um esfregaço e posterior coloração pelo método de Gram, onde este grupo bacteriano apresenta-se agrupado caracteristicamente na forma de .“cachos  de uva”
  • Quando não se consegue a diferenciação entre estafilococos e estreptococos, é recomendável a utilização da prova da catalase.
  • A catalase não é produzida pelos estreptococos, e a prova, que pode ser realizada em lâmina ou em tubo, se positiva, caracteriza a presença dos estafilococos.
  • Após a caracterização de uma colônia como sendo estafilococo, o passo  seguinte consiste em identificar se esta é ou não S. aureus. Como relatado anteriormente, a prova da coagulase é utilizada pela maioria dos  laboratórios para a identificação presuntiva desta espécie.
  • As cepas bacterianas coagulase negativa identificadas pelos métodos ordinários,         S. epidemidis e S. saprophyticus, têm sua diferenciação através da prova de sensibilidade à novobiocina sendo que a maior parte das cepas de S.saprophyticus é  resistente a este antibiótico ao contrário do S. epidemidis  que  mostra-se  sensível.
  • A fermentação do manitol e a prova da desoxiribonuclease já foram muito utilizadas na diferenciação das espécies de estafilococos, entretanto sua utilização atual encontra-se limitada.